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概述

免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程：樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量?jī)?yōu)化、后續(xù)研究。小愛(ài)已經(jīng)給大家詳細(xì)介紹了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之樣本制備（一）》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之細(xì)胞分選（二）》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定（三）》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之擴(kuò)增&培養(yǎng)（四）》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之質(zhì)量?jī)?yōu)化（五）》今天我們繼續(xù)來(lái)了解一下后續(xù)研究。

后續(xù)研究（Follow-Up Study）：運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、細(xì)胞共培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究免疫細(xì)胞的功能（殺傷能力、分泌細(xì)胞因子、吞噬功能、增殖能力等）。免疫細(xì)胞可以做的后續(xù)研究實(shí)在是太多了，比如：CAR-T/NK/M，腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)、類(lèi)器官免疫共培養(yǎng)，細(xì)胞因子風(fēng)暴等等，小愛(ài)在這里拋磚引玉，給大家介紹3個(gè)免疫細(xì)胞研究的熱門(mén)思路：NK細(xì)胞殺傷能力鑒定、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、Treg體外抑制實(shí)驗(yàn)。

NK細(xì)胞殺傷能力鑒定

NK作為自帶免疫記憶的自然殺傷細(xì)胞，對(duì)其殺傷功能的研究也是十分火熱。

NK細(xì)胞主要通過(guò)以下四個(gè)途徑殺傷靶細(xì)胞：

①NK細(xì)胞脫顆粒，釋放穿孔素和顆粒酶殺傷靶細(xì)胞；

②活化的NK細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞因子來(lái)殺傷靶細(xì)胞；

③通過(guò)死亡受體如Fas/FasL和TNF-α/TNFR-1途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡；

④介導(dǎo)ADCC作用殺傷靶細(xì)胞[1]。

圖1 NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的四種途徑

體外研究NK細(xì)胞殺傷功能主要是將NK細(xì)胞與靶細(xì)胞（通常是K562細(xì)胞）共培養(yǎng)，然后通過(guò)檢測(cè)靶細(xì)胞釋放的酶或者用CAM、CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)熒光，也可以通過(guò)MTT/CCK8檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，從而得出NK細(xì)胞的殺傷活性，也可以檢測(cè)NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或者脫顆粒指標(biāo)CD107a。當(dāng)然我們可以換成其他的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。

小愛(ài)也給大家整理了步驟可以參考：

1、將用熒光染料GFP，CFSE標(biāo)記的靶細(xì)胞（一般為腫瘤細(xì)胞）接種到96孔板中，不同腫瘤細(xì)胞的接種密度可以參考圖2；

圖2 用于NK和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)中不同腫瘤細(xì)胞的接種密度

2、第二天，將培養(yǎng)基更換成NK細(xì)胞的培養(yǎng)體系，并按照靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞(NK)1:3的比例加入NK細(xì)胞，0-12h分別進(jìn)行熒光顯微鏡拍照；

注意：靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的共培養(yǎng)比例以及時(shí)間均需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

圖3 不同上皮細(xì)胞系在與NK共培養(yǎng)中的累積存活曲線(xiàn)

表1 腫瘤免疫共培養(yǎng)表格

混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）

混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（Mixed Lymphocyte Reaction, MLR）也稱(chēng)作混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，是指在抗原提呈細(xì)胞刺激下，T細(xì)胞發(fā)生增殖和活化，根據(jù)淋巴細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)組織相容性抗原差異和對(duì)異體細(xì)胞的反應(yīng)能力?？梢苑譃?strong>雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。體外研究中，通常也會(huì)檢測(cè)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ、T細(xì)胞增殖抗原CD107a。

雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：將來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同供體的 PBMC 共培養(yǎng)，使來(lái)自?xún)蓚€(gè)供體的T細(xì)胞發(fā)生雙向活化。

單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：將從一個(gè)供體分離的 CD4+T細(xì)胞與從另一個(gè)供體分離的DC相結(jié)合，從而使 T 細(xì)胞發(fā)生單向活化。

圖4 單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體外研究示意圖

小愛(ài)以單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)為例給大家介紹實(shí)驗(yàn)步驟：

1、用50μg/mL的絲lie霉素37℃處理來(lái)自供體B的PBMCs 30min，這些細(xì)胞作為刺激細(xì)胞；

2、300×g離心5min，去除絲lie霉素，按照2x10⁶個(gè)PBMCs/mL（或者磁珠分選出DC細(xì)胞）接種到24孔板(250uL)中；

3、再加入250uL來(lái)自供A的個(gè)PBMCs(2x10⁶cells/mL)（或者磁珠分選出T細(xì)胞），作為應(yīng)答細(xì)胞；

4、將刺激細(xì)胞和應(yīng)答細(xì)胞構(gòu)成的MLR置于37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)七天；

5、7天后可以檢測(cè)應(yīng)答細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌情況。

表2 腫瘤免疫共培養(yǎng)表格

CD4+CD25+Treg和CD8+T體外抑制實(shí)驗(yàn)

體外抑制實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)在于，因?yàn)橹挥蠺resp細(xì)胞（CD4+CD25-）或Treg細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，所以可以直接評(píng)估Treg細(xì)胞對(duì)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用。除CD8+T細(xì)胞外，也可以通過(guò)改變實(shí)驗(yàn)條件來(lái)評(píng)估Treg細(xì)胞對(duì)其它免疫細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞)的影響。

小愛(ài)也給大家整理了文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)步驟，可以作為參考：

1、CD3/CD28磁珠的清洗：

1）在離心管里重懸磁珠（渦旋超過(guò)30s，或者顛倒混勻5min）；

2）將確定體積的磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中；

3）加入等體積的PBS緩沖液含1%的HSA，或者至少1ml的體積，進(jìn)行重懸；

4）把離心管放在磁力架（磁珠專(zhuān)用）上1min，隨后棄去上清；

5）將離心管從磁力架（磁珠專(zhuān)用）上轉(zhuǎn)移下來(lái)，用相同體積的PBS緩沖液含1%的HSA重懸磁珠（第二步最初體積的磁珠）。

2、取50μL CD4+CD25+Treg細(xì)胞（1×10⁵cells/孔）。每孔加50μL CD8+T細(xì)胞作為應(yīng)答T (Tresp)細(xì)胞（1×10⁵cells/孔）。每孔加入已經(jīng)洗過(guò)的CD3/CD28磁珠，磁珠和細(xì)胞的比例調(diào)整為1:1 。

注意：在此步驟中，標(biāo)記和建立對(duì)照孔如下：未刺激CD8+T（不含anti-CD3/CD28）；刺激的CD8+T細(xì)胞（含anti-CD3/CD28）；刺激的Treg細(xì)胞（含anti-CD3/CD28）。Treg細(xì)胞可以用wan全培養(yǎng)基稀釋?zhuān)圆煌壤腡resp細(xì)胞與Treg細(xì)胞（1:0.25-1:1）共培養(yǎng)；

3、各孔加50μL或適當(dāng)體積的培養(yǎng)基，總體積為200μL。用鋁箔蓋住板子，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)72h；

4、培養(yǎng)72h后進(jìn)行細(xì)胞因子產(chǎn)生分析，將每孔上清液分離到另一個(gè)板上，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，檢測(cè)IFN-γ水平；

5、將每孔上清液分離后，用FACS緩沖液清洗含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿，4°C，300g離心2min，洗3次；

6、洗滌后，棄去上清。用50μL的抗體緩沖液（anti-CD4、anti-CD8和細(xì)胞活力檢測(cè)試劑）重懸細(xì)胞，對(duì)增殖的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行染色（在獲得CD8+T細(xì)胞時(shí)，可使用追蹤細(xì)胞增殖的染料進(jìn)行標(biāo)記）。4°C避光孵育20min；

7、4°C，300g離心2min，洗兩次。洗滌后，棄上清，用100μL固定緩沖液4℃避光固定20min；

8、4°C，300g離心2min，洗兩次。200μL FACS緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)記CD8+T細(xì)胞增殖情況。

圖6 活化的Treg細(xì)胞抑制CD8+T細(xì)胞的增殖以及分泌IFN-γ

今天講解就到這了，大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題，歡迎一起交流哦！

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