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熒光探針是潛在的熒光團，可根據(jù)生物微環(huán)境變化、與被分析物相互作用或特定化學反應顯示熒光信號。由于其具有操作簡單、選擇性好、靈敏度高、檢測范圍廣、響應速度快以及對樣品損傷小等優(yōu)點，已經(jīng)被成功應用于生物醫(yī)學、生命科學及環(huán)境科學等領域。

鈣離子熒光探針：

鈣（Calcium）是一種重要的且普遍存在的第二信使，參與調(diào)控各種各樣的細胞過程，包括細胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、肌肉收縮和胞吞作用。響應于大量的刺激物，鈣離子（Ca2⁺）從胞內(nèi)的儲存池釋放出來，而胞內(nèi)Ca2⁺濃度的增加會引起細胞功能的活化、調(diào)節(jié)和終止。許多泵和離子通道都允許這種陽離子進入和離開細胞，并且在細胞質(zhì)和胞內(nèi)蓄池間移動。

圖 CaSR（鈣感應受體）在高葡萄糖處理的心臟成纖維細胞激活中的作用示意圖^[1]

Fluo 3-AM是常用的檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一。它穿透細胞膜進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細胞內(nèi)，F(xiàn)luo-3若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當它與細胞內(nèi)鈣離子結合后可以產(chǎn)生較強的熒光，最大激發(fā)波長為506nm，最大發(fā)射波長為526nm。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右，發(fā)射波長為525～530nm?？梢允褂眉す夤簿劢癸@微鏡或流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。Fluo 4-AM是Ca²⁺熒光探針Fluo 3-AM的改良版本。

Fluo 4-AM相比較于Fluo 3-AM的優(yōu)勢：

1）激發(fā)和發(fā)射波長往短波長偏移10nm，更接近氬激光器的波長，因此，當使用488nm進行熒光激發(fā)，得到更強的熒光信號，比Fluo-3強一倍；
2）50μg小包裝供應，使用方便，且能很好保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

圖 用Fluo 3-AM對胞漿Ca²⁺進行染色，并通過檢測熒光強度進行評估^[1]

活性氧（ROS）探針：

活性氧類物質(zhì)（Activated oxygen species，AOS），又稱反應性氧類物質(zhì)（Reactive oxygen species，ROS），體內(nèi)的各種生理和病理過程都能生成。ROS的生理效應通過與大量易氧化的胞內(nèi)物質(zhì)反應來發(fā)揮，這些物質(zhì)包括NADH、NADPH、抗壞血酸、組胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、蛋白質(zhì)和核酸。ROS還能氧化膽固醇和不飽和脂肪酸，引起膜脂質(zhì)氧化。

2′,7′-二氯二氫代熒光黃二醋酸（2′,7′-Dichlorofluorescin Diacetate, DCFH-DA），是一種通用的氧化應激指示劑?？蓾B透細胞膜，本身無熒光。一旦進入細胞后，被細胞酯酶水解生成2′,7′-二氯二氫熒光素（DCDHF）并進一步被氧化生成強熒光的2′,7′-二氯熒光素（DHF）。DCFH-DA與細胞內(nèi)氧化應激產(chǎn)生的多種活性氧都有反應，包括過氧化氫（H₂O₂）、過氧基（ROO•）和過氧亞硝基陰離子（ONOO^-）。DCFH-DA常用來監(jiān)測細胞氧化還原過程。二氫羅丹明123（DHR123）是DCDHF的類似物，具有親脂性，通過細胞膜擴散。存在活性氧物質(zhì)的情況下，細胞內(nèi)的二氫羅丹明123氧化為熒光R123，定位在線粒體中。

圖 DCFH-DA探針監(jiān)測癌細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生^[2]

硫化氫（H₂S）熒光探針：

硫化氫（H₂S）是繼一氧化碳和一氧化氮之后，第三種可在生命體內(nèi)發(fā)揮生理作用的內(nèi)源性氣體信號分子。該氣體分子在心血管和神經(jīng)系統(tǒng)中擔負著重要的生理病理調(diào)節(jié)作用。在生物檢測技術手段中，熒光探針法具有選擇性好、靈敏度高、對生物樣品損傷小以及可實現(xiàn)實時原位檢測等優(yōu)勢，故應用熒光探針法檢測細胞內(nèi)H₂S濃度的變化是近年來研究熱點之一。

WSP-1（Washing State Probe-1）是一種含活性二硫化物的熒光探針，用來檢測生物樣本和細胞內(nèi)的H₂S。通過基于反應的熒光開啟策略，WSP-1選擇性且快速與H₂S反應，生成苯丙二硫醇酮（benzodithiolone）和一種熒光化合物（見圖1）。WSP-5（Washing State Probe-5）也是一種H₂S熒光探針，WSP-5與WSP-1相比，其靶向H₂S表現(xiàn)出更快的熒光開啟速率和更靈敏的檢測限。

圖 WSP-1檢測H₂S反應機制^[3]

應用實例：

圖 用WSP-1對植物細胞進行內(nèi)源性H₂S的示蹤和熒光成像檢測^[4]

圖 用WSP-5對SHSY5Y和U87MG細胞進行H₂S熒光顯微鏡成像檢測^[5]

熒光探針不僅可以檢測陽離子和陰離子，還可以檢測活性氧及硫化氫等小分子化合物。近年來檢測生物酶和細菌等生物活性物質(zhì)的熒光探針也越來越多。值得一提的是，由于部分熒光探針具有良好的生物相容性、高靈敏度、無創(chuàng)性、穩(wěn)定的發(fā)射特性和實時成像等優(yōu)點，使得基于熒光探針的生物成像技術發(fā)展迅速，現(xiàn)在已成為可視化多種生理和病理過程的有力工具。

[1] Yuan H , Fan Y , Wang Y , et al. Calcium-sensing receptor promotes high glucose-induced myocardial fibrosis via upregulation of the TGF-beta(1)/Smads pathway in cardiac fibroblasts[J]. Nature reviews neuroscience,2019(2):20.
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