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PCR技術(shù)的前世今生

科學(xué)家對(duì)核酸的研究已有100多年歷史，20世紀(jì)70年代初人們就致力于研究基因的分離技術(shù)。Khorana等于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增理念：DNA變性解鏈后與相應(yīng)引物雜交，用DNA聚合酶延伸，重復(fù)該過程便可以克隆基因^[1]。因?yàn)楫?dāng)時(shí)的技術(shù)尚未成熟，該設(shè)想一直未被證實(shí)。

直到在1985年，Mullis等用大腸桿菌DNA聚合酶體外擴(kuò)增哺乳動(dòng)物單拷貝基因成功（發(fā)明人Kary Banks Mulis也因此榮獲了后期的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）。1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR技術(shù)，使擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和效率大大提高，并簡(jiǎn)化了操作程序，最終實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增的自動(dòng)化，迅速推動(dòng)了PCR的應(yīng)用和普及^[2]。隨著技術(shù)不斷改進(jìn)，PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、植物病理學(xué)等研究領(lǐng)域。它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測(cè)定，也從原先只擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)kb的DNA片段。

PCR技術(shù)原理

PCR技術(shù)(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，指在DNA聚合酶的催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)。通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。反應(yīng)的基本成分包括模板DNA、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。

PCR技術(shù)的基本原理，類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR技術(shù)主要包含以下幾個(gè)過程：

1）模板DNA變性：模板DNA經(jīng)94℃加熱一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈解離形成單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；
2）模板DNA與引物退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性形成單鏈后，溫度下降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
3）引物的延伸：DNA模板—引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶作用下，在72℃左右，以dNTPs為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原則，合成一條新鏈。新合成的子鏈又重復(fù)循環(huán)變性——退火——延伸三個(gè)過程，以獲得更多的新鏈。每個(gè)循環(huán)需要2-4min，2-3h就能將待擴(kuò)增的目的基因擴(kuò)增放大幾百倍。

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PCR的種類

到目前為止，PCR技術(shù)發(fā)展出十幾種之多，本次小愛給大家科普下幾種常用的PCR。

1、普通PCR

就是我們實(shí)驗(yàn)室常用的PCR，技術(shù)原理如上所述。普通PCR技術(shù)是分子生物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，可以用于基因的分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)性研究，定性判斷核酸含量；同時(shí)用于疾病的診斷或任何與DNA、RNA相關(guān)的檢測(cè)應(yīng)用。下面以一個(gè)實(shí)驗(yàn)為例介紹普通PCR的常規(guī)操作步驟：

實(shí)驗(yàn)所需試劑及耗材設(shè)備：

模板DNA、引物、Taq DNA聚合酶(5U/uL)、包含15mmol/L Mg²⁺的Buffer、ddH₂O、PCR儀、移液槍、PCR板、吸頭

實(shí)驗(yàn)步驟：

1）配置PCR反應(yīng)體系：

在PCR反應(yīng)板中依次加入下列溶液：

模板DNA 2uL；上游引物1uL；下游引物1uL；dNTPs  1.5uL；Tag酶0.5uL；ddH₂O 使總體系達(dá)到20uL。

2）設(shè)置PCR反應(yīng)程序：

94℃ 3min；94℃ 45s；55℃ 45s；72℃ 45s；72℃ 5min；4℃ 1h

3）上樣，啟動(dòng)反應(yīng)程序；

4）擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

愛必信擁有包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反應(yīng)緩沖液的PCR反應(yīng)液，具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可最大限度的減少人為誤差。使用時(shí)只需加入DNA模板和引物既可。

2、熱啟動(dòng)PCR

熱啟動(dòng)PCR(Hot Start PCR)是指它的Taq DNA聚合酶只有在樣品溫度至少超過70℃時(shí)才發(fā)揮作用的PCR，可提高反應(yīng)的特異性。Taq DNA聚合酶通常在比適宜溫度低得多的條件下仍有較強(qiáng)的活性。PCR反應(yīng)的最初加熱過程中，樣品溫度上升到70℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結(jié)合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致非靶序列的擴(kuò)增，影響反應(yīng)的特異性。熱啟動(dòng)可減少非靶序列的擴(kuò)增，提高反應(yīng)的特異性。在引物設(shè)計(jì)時(shí)如果某位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作等情況，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。愛必信熱啟動(dòng)PCR相關(guān)試劑如下：

3、高保真PCR

高保真PCR主要依賴于高保真酶。普通Taq酶具有5'→3'DNA聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性，缺少3'→5'的外切酶活性因而在合成中對(duì)某些單核苷酸錯(cuò)配沒有校正功能。而高保真酶具有很強(qiáng)的校對(duì)功能，其保真度比普通Taq酶高50倍，遠(yuǎn)高于其他同類酶。因此高保真PCR特別適用于質(zhì)粒構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。愛必信高保真PCR相關(guān)試劑如下：

4、長(zhǎng)片段擴(kuò)增

Taq DNA聚合酶在擴(kuò)增長(zhǎng)度超過4kb的PCR產(chǎn)物時(shí)通常會(huì)失敗，原因包括非特異性引物退火、DNA模板中的二級(jí)結(jié)構(gòu)和次優(yōu)循環(huán)條件——所有這些因素對(duì)較長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增比對(duì)較短的PCR產(chǎn)物有更大的影響。在長(zhǎng)程PCR中，防止DNA損失特別重要，因?yàn)槟０鍍?nèi)的單個(gè)DNA損傷足以使PCR酶停滯。PCR循環(huán)過程中的DNA損傷可以通過穩(wěn)定反應(yīng)pH的特定緩沖物質(zhì)最小化。商業(yè)PCR試劑盒是專門為克服長(zhǎng)程PCR的挑戰(zhàn)而設(shè)計(jì)的。

[1] 黃留玉.PCR新技術(shù)原理,方法及應(yīng)用[M].化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 鄧小紅,任海芳.PCR技術(shù)詳解及分析[J].重慶工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007, 24(1):29-33.DOI:10.3969/j.issn.1672-058X.2007.01.009.

[3] 粟玉剛,程天印,董歡.熱啟動(dòng)PCR技術(shù)的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息, 2009(3):2.DOI:10.3969/j.issn.1671-6027.2009.03.004.

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