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CRISPR/Cas是近幾年來生物醫(yī)學領域最火的技術之一，可控性和通過修改sgRNA靶點就能改變Cas9切割位點的便捷性使CRISPR/Cas的研究如火如荼，該技術的潛力不言而喻，但是脫靶效應的潛在危險和臨床運送載體效果不佳制約著CRISPR/Cas的發(fā)展。

（圖片來源于網(wǎng)絡，僅供學習參考用）

近幾年，研究人員已經(jīng)通過改進Cas酶、優(yōu)化sgRNA設計、預測靶向結果和對基因表達時空調控等手段很大程度上降低了脫靶效應，而優(yōu)化運送Cas系統(tǒng)的載體仍然是一個重大挑戰(zhàn)，最近鄭州大學藥學院張開翔教授團隊發(fā)表了一篇名為“Biomimetic Mineralized CRISPR/Cas RNA Nanoparticles for Efficient Tumor-Specific Multiplex Gene Editing"的文章，有望解決體內多組分RNA遞送的難點，為基于RNA的CRISPR/Cas9基因編輯提供了一種新策略。

Mg²⁺在RNA結構穩(wěn)定中起主要作用，并通過參與RNA與核糖體的結合促進RNA翻譯，Mg₂PPi（焦磷酸鎂）是核酸合成過程中常見的副產(chǎn)物，利用焦磷酸酶可以有效溶解Mg₂PPi的特性，確保遞送載體的RNA在細胞內的有效釋放。以RNA為模板的Mg₂PPi晶體的成核和生長可以將Cas9 mRNA、sgSurvivin、sgPLK1和sgHPV以所需的化學量包埋在單個納米顆粒（稱為多基因編輯RNF）內，用聚乙烯亞胺（PEI）凝聚納米顆粒，并涂以透明質酸（HA）。該Mg₂PPi仿生礦化一體化載體系統(tǒng)為基于RNA的多重基因編輯在體內的應用提供了一種潛在的策略。

該研究通過一系列實驗得出以下結果：

1）當EGFP mRNA濃度為666ng/μL時，形成的仿生礦化納米顆粒（890nm）相對較小，包封效率高（88.75%）；
2）透射電鏡（TEM）顯示，由EGFP mRNA合成的仿生礦化納米顆粒大小分布均勻，并保留了清晰的花狀結構；
3）元素圖譜證實了EGFP RNF中存在C、N、O、Mg和P，這說明EGFP RNF可能由mRNA和Mg₂PPi組成，表明mRNA在顆粒內成功結合；
4）以RNA為模板的Mg₂PPi仿生礦化過程不會破壞Mg₂PPi的晶體結構，并且RNA被均勻地納入晶體中；
5）瓊脂糖凝膠電泳分析表明，焦磷酸酶能有效分解EGFP RNF，釋放EGFP mRNA；
6）轉染結果顯示EGFP RNF在HeLa細胞中熒光明顯，保留了表達蛋白質的能力；
7）仿生礦化RNA納米顆粒具有*的RNA裝載和保存特性。比脂質納米顆粒（LNP）高8-9倍的RNA負載能力，EGFP RNF在4°C下放置1個月或在-20°C下放置6個月后仍然保持形態(tài)穩(wěn)定，在4℃下保存35天后表達能力沒有下降；
8）仿生礦化RNA遞送策略是通用并可擴展的；
9）EGFP mRNA NPs的轉染效率高于EGFP mRNA@ PEI；

10）EGFP基因編輯（NPs）成功地將所有CRISPR/ Cas9 RNA組分傳遞到人類癌細胞系中，實現(xiàn)了EGFP的高效基因組編輯；

11）多基因編輯NPs不僅可以在三個位點自主進行基因編輯，而且在基因編輯后對HeLa細胞表現(xiàn)出良好的誘導凋亡作用；
12）多基因編輯NPs在體內實現(xiàn)了有效的多重基因組編輯。與對照組相比多基因編輯NPs治療可顯著抑制腫瘤生長，腫瘤體積減少78%，腫瘤重量減少4%，多基因編輯NPs后腫瘤組織細胞密度降低，凋亡顯著增加；

13）仿生礦化RNA納米顆粒可以在體內實現(xiàn)非肝臟部位的精確靶向，同時避免LNP在肝臟的攔截，在主要器官中檢測到的基因破壞事件幾乎可以忽略不計，靜脈注射多基因編輯NPs后12小時，在腫瘤部位觀察到最大信號；

14）多基因編輯NPs在不引起小鼠主要器官的基因破壞和病理改變的情況下實現(xiàn)了高效的多基因編輯，作為納米載體具有較高的生物安全性。

單基因編輯不足以改變動物表型，實現(xiàn)復雜的生物學應用通常需要同時干擾多個基因位點，CRISPR同時靶向多個基因的能力是一個顯著的優(yōu)勢，該研究創(chuàng)立的Mg₂PPi仿生礦化一體化載體系統(tǒng)是一種簡單廉價的方法，不需要復雜的原材料或昂貴的設備，適合低成本批量生產(chǎn)和多種應用，為有效的mRNA遞送提供了另一種解決方案，有望促進基于mRNA的治療在體內的應用。

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Biomimetic Mineralized CRISPR/Cas RNA Nanoparticles for Efficient Tumor-Specific Multiplex Gene Editing

Yan Liang, Jingge Zhang, Chenlu Xu, Jinjin Wang, Wenshuai Han, Jiali Yang, Sixuan Wu, Jingyi An, Junjie Liu, Zhenzhong Zhang, Jinjin Shi, and Kaixiang Zhang

ACS Nano Article ASAP

DOI: 10.1021/acsnano.3c04116

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