免疫熒光技術（Immunofluorescence technique，IF ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。
多重免疫組化（mIHC）：主要的技術原理來自TSA技術，TSA即酪酰胺信號放大(Tyramide signal amplification)是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。該技術可與高性能染料Alexa Fluor®、傳統(tǒng)熒光染料和比色檢測系統(tǒng)相兼容。 TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點)，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積，與隨后加入的Streptavidin—HRP/熒光基團結(jié)合，經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以結(jié)合大量的酶分子or熒光基團，結(jié)果使其檢測信號得到幾何級放大。
mIHC和IP的區(qū)別：
| | 多重免疫組化(mIHC) | 免疫熒光(IP) | | 靶點數(shù)量 | 可同時染色7色（含dapi） | 一般標記三種(含dapi)大于三種效果差 | | 一抗種類 | 同一種屬的不同抗體即可滿足要求 | 不同種屬的不同抗體 | | 二抗 種類 | 不同種屬的不同抗體 | 連接熒光探針的不同種屬二抗 | | 染色策略 | 分步染色，多次重復進行免疫組化操作 | 樣本抗原的空間位置的差異，需要設計復雜的染色策略。樣本/靶點的差異導致染色策略的差異，染色過程復雜、多變 | | 染色效果 | 高染色分辨率和染色特異性，信號強度更強,更穩(wěn)定,淬滅時間更長，無背景影響，各靶點的信噪比大大提高，尤其適合組織基于單細胞的定量分析 | 亮度較弱,容易淬滅,各種抗體間存在互相影響，背景較高，對基于單細胞的定量分析不利。 | | 實驗成本 | 1同一種屬的一抗和二抗，價格相對便宜。
2簡單的染色策略和無需任何重復的預實驗，即可掌握整個染色技術，大大縮小了預實驗的材料損耗。
3一抗和二抗工作濃度更低,單次費用更低 | 1不同種屬的抗體價格存在差異，一般種屬稀少的價格高。
2不同種屬的二抗，價格存在差異，一般稀少的種屬價格高。
3尋找合適的染色策略，復雜的多次重復的預實驗大大的增加了實驗成本 | | 應用范圍 | 二抗具備通用性，因此實驗室中所有的研究領域均可使用 | 二抗不具備通用性，實驗室中應用領域受到局限 |
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