對于做液相色譜分析的人來說，我們先接觸到的往往是對于弱極性或者中等極性化合物的分離。對于這類化合物的分析來說，常用的是C8或者C18的反相色譜柱，而且對于這類化合物的方法開發(fā)及條件優(yōu)化我們也都比較的熟悉。但是近些年來越來越多的人開始關注對極性化合物的分析，尤其是隨著對體內(nèi)代謝物的研究不斷發(fā)展，對我們分析極性代謝物提出了更多的挑戰(zhàn)。
其實現(xiàn)在我們很多人也會采用反相色譜柱來分析一些極性化合物，比如流動相中加入離子對試劑或者采用一些極性封端的反相柱。當然這些比較經(jīng)典的方法對于很多極性化合物的分析效果都是不錯的，但是都會面臨一些問題。
比如，加入離子對試劑，本身離子對試劑對于色譜柱的壽命會有一定的影響，流動相制備也相對復雜，另外很多時候也沒法與質(zhì)譜兼容；采用極性封端類的柱子，流動相中會用到比較高比例的水，壓力會比較高，而且即使水相比例較高，對于一些很強極性的物質(zhì)，仍然難以得到很好地保留。而HILIC可以克服以上的缺點，大大滿足您對極性化合物的分析要求。
什么是HILIC ？
HILIC是 Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography（親水作用液相色譜）的簡稱。我們首先要清楚，HILIC不是某個廠家的色譜柱系列或品牌，也不是某個鍵合相，它代表的是一種分離機理，而具備這種分離機理的鍵合相種類非常多。在HILIC中，固定相是極性的，流動相中的水相部分表現(xiàn)為強洗脫溶劑，這與傳統(tǒng)的反相色譜法*相反。
HILIC 發(fā)展歷史
HILIC分離模式早可以追溯到1951年，Gregor等人描述了一種離子交換樹脂表面的富水層概念，在1975年的時候，科學家在氨基柱上實現(xiàn)了糖類的分析也是屬于HILIC的機理，但是直到1990年科學家Alpert才正式提出了HILIC的概念,但是這時候HILIC并沒有得到廣泛的推廣，到了2000年以后，越來越多的人開始認識并使用HILIC機理進行極性化合物的分析，HILIC才得到了廣泛的認可。
HILIC 的作用機理
HILIC可以被認為是反相液相色譜通過采用極性固定相來運行的。HILIC中采用的流動相是含有少量水/緩沖鹽或其他極性溶劑的高比例有機相（>60%，常用乙腈）。流動相中的水形成一個富水層被吸附在固定相表面，極性物質(zhì)首先進入富水層得到保留。極性化合物是通過一個復雜的混合模式被保留的，包括：富水層和流動相之間的親水分配、極性官能團和固定相間的氫鍵作用以及離子官能團的靜電作用。當然，親水分配是主要的保留模式。從保留機理來看，HILIC和反相色譜柱是有著非常大的差別的。
HILIC 流動相
HILIC常用的流動相是乙腈/水系統(tǒng)。比例：有機溶劑>60%，流動相中至少需要3%的水相（因為HILIC保留機理是通過形成富水層來實現(xiàn)的）。洗脫強度：四氫呋喃<丙酮<乙腈<異丙醇<乙醇 <甲醇<水。對于條件摸索來說，等度條件下建議80%乙腈為起始條件來調(diào)整比例；梯度條件建議95%乙腈------60%乙腈。對于HILIC來說，我們有時也會在流動相中加入緩沖鹽，建議使用甲酸銨/乙酸銨（常用乙酸銨）緩沖液，可以同時滿足溶解度（醋酸鹽在高比例乙腈中溶解度較好）以及質(zhì)譜檢測器兼容性的要求。
HILIC 固定相
上面我們提到，HILIC保留機理的固定相種類非常多。常用的包括：
1，裸硅膠（如賽默飛的Hypersil Silica, SyncronisSilica及Accucore HILIC等），這種固定相在HILIC中也是應用廣泛的固定相，未鍵合硅膠由于表面具有硅羥基，具有一定的陽離子交換活性，所以可以增強對堿性化合物的保留。
2，兩性離子固定相（如Syncronis HILIC）,此種固定相既有陽離子基團，又有陰離子基團，二者比例1：1，因此表面靜電荷為零。對于分析中性極性化合物是一個不錯的選擇。
3，酰胺鍵合相（如Accocore Amide HILIC）,通過丙基或者專有連接基團將酰胺官能團鍵合到硅膠表面，此種鍵合相能夠提供固定相和分析物之間的強有力的氫鍵作用，保留能力強，對于碳水化合物分析是一個不錯的選擇，如聚糖的分析。酰胺鍵合相不太容易產(chǎn)生不可逆吸附（氨丙基固定相經(jīng)常會遇到這樣的問題），同時酰胺類色譜柱表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。其他的HILIC固定相包括：二醇基、氨丙基（氨基柱）、氰丙基（氰基柱）以及其他專有的特殊官能團鍵合相。
HILIC 的優(yōu)勢及不足
通過上面我們介紹到的HILIC的機理及流動相和固定相的特征我們不難得出HILIC在分析極性化合物方面的優(yōu)勢。首先，HILIC機理對于幾乎所有的極性化合物都有較好的保留，大大解決了我們分析極性化合物時遇到的難以保留的問題。其次，由于HILIC流動相有機相比例很高，所以對于質(zhì)譜檢測器來說，可以確保去溶劑化，大大提高化合物的信噪比。另外，較高的有機相比例組成也會帶來更低的色譜柱壓力，在這個基礎上，我們采用小粒徑或者小內(nèi)經(jīng)的色譜柱時就不會受到壓力的困擾。
HILIC的優(yōu)勢是很明顯的，但是對于任何一種分離手段，也都存在一些不足之處。由于HILIC保留機理比較復雜，所以在方法優(yōu)化及色譜柱選擇上會比普通反相色譜柱要復雜。HILIC保留機理由于需要形成富水層，所以色譜柱平衡時間會稍長，建議是普通反相的2-3倍，當然，這個問題其實在反相采用離子對試劑分析的時候也會碰到。另外，由于極性化合物在水中的溶解性好，但是如果我們采用純水相來溶劑樣品的話，有時候會出現(xiàn)溶劑效應帶來的色譜峰展寬，就如同我們反相分析時用純有機相溶解樣品有時也會出現(xiàn)類似的問題。所以，建議采用純有機相或者與流動相比例接近的溶劑來溶解樣品。
通過以上關于HILIC的介紹，相信大家對HILIC有了更進一步的了解。在以后我們分析極性化合物方面又多了一個更有力的工具！
