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上海嘉鵬
主營產(chǎn)品： 超微量分光光度計,核酸蛋白檢測儀,超微量紫外分光光度計,nano光度計,超微量核酸蛋白檢測儀 |
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2021-8-26 閱讀(4426)
那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下關于瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程：
1、 DNA的分子大小及構型:
不同構型DNA的移動速度次序為：共價閉環(huán)DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。當瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0），由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度。
2、 瓊脂糖濃度：
一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA段所需膠濃度是 1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%，DNA段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、 DNA分子的構象 ：
當DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動*快，而線狀雙鏈DNA移動*慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構象引起還是因 為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種 DNA。
4、 電源電壓 ：
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，不同分子量的DNA段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA段的分辨率達到*大電場強度不宜高于5V/cm。
5、 嵌入染料的存在 ：
熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15％。
6、 離子強度影響 ：
電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率*小，幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導很高并明顯產(chǎn)熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。 對于天然的雙鏈DNA，常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成濃縮母液，儲于室溫。
以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結關于瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程。
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