關(guān)鍵詞:載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>設(shè)計siRNA靶序列
在制備siRNA 前都需要單獨設(shè)計siRNA序列.研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞,zui有效的siRNAs是21-23個堿基大小、3’端有兩個突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn)，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。
1.  選擇siRNA靶位點
從轉(zhuǎn)錄AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA 3’端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions,UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果 
2.  序列同源性分析
將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人或者小鼠、大鼠等等）進(jìn)行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚，可能是位置效應(yīng)的結(jié)果,因此對于一個目的基因，一般要選擇3-5個靶位點來設(shè)計siRNA。
3.  設(shè)計陰性對照
一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂。當(dāng)然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。
合成模板
1.  合成編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈，模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點，同時兩端分別設(shè)計 BamH I 和 Hind III 酶切位點，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點的 BamH I 和 Hind III 酶切位點之間。
2.  95℃，5 min，緩慢退火， DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。
連接與轉(zhuǎn)化
1.  將100 μl感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍。
2.  取5 μl連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物，在冰上放置30分鐘。
3.  將管放入預(yù)加溫到42℃的水浴中，熱激90秒?？焖賹⒐苻D(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1~2分鐘。
4.  每管中加700 μl LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，進(jìn)行復(fù)蘇。
5.  室溫4 000 rpm離心5分鐘，棄去上清后，用剩余100 μl培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面.注意：細(xì)胞用量應(yīng)根據(jù)連接效率和感受態(tài)細(xì)胞的效率進(jìn)行調(diào)整。
6.  將平板置于室溫直至液體被吸收。
7.  倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12~16小時后可出現(xiàn)菌落。
注意事項    
1. 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA"二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。
2. 將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。
3.  選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到zui有效的siRNA序列。
4.  一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有負(fù)對照，作為負(fù)對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。