用4℃預(yù)冷的1×PBS（pH7.2-7.4，0.01M，cell culture，貨號：P1020）沖洗組織，去除殘留血液，并去除組織上的筋膜、脂肪等冗余組織；

稱重后將組織用眼科剪刀和鑷子剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:5-1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)5-9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，不建議反復(fù)凍融超過2次。因為過多的反復(fù)凍融可能影響細胞因子含量的穩(wěn)定性。最后，將組織勻漿液于2-8℃，5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測；

處理樣本的過程就是收集細胞因子或目標(biāo)蛋白的過程，由于細胞因子或蛋白結(jié)構(gòu)容易改變和降解，組織勻漿過程完成后，儲存也非常重要，特別需要注意的是，不要反復(fù)凍融，樣本處理之后可分裝密封保存，4度保存應(yīng)小于1周，-20 度不應(yīng)超過3個月，-80度不應(yīng)超過6個月。在標(biāo)本使用前應(yīng)室溫緩慢均衡溶化，不能進行加熱。

超聲組織勻漿液的制備方法

提前將剪刀、鑷子用75%酒精消毒，然后用預(yù)冷的1×PBS滌浸泡，用來剪切、剪碎組織；

對應(yīng)將要提取蛋白的組織編號，然后給EP管編號，放在冰上進行預(yù)冷。用預(yù)冷的PBS （0.01M，pH=7.4）沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎；

配置裂解液：提前將蛋白酶抑制劑（貨號：P6730）、磷酸酶抑制劑（貨號：P1260）、PMSF（貨號：P0100）分別按照1:100的體積比加入到RIRP裂解液中，快速搖勻后靜置冰上即可；

將剪碎的組織，加入對應(yīng)體積的裂解液（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的裂解液，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄）；

在冰上，用剪刀將組織剪碎（剪至組織顆粒非常細小，甚至剪成糜狀物），然后去超聲破碎即可。（超聲的條件：儀器：新芝 Scientz-IID；破碎條件：180W超聲3s關(guān)6s，超聲一次時間1min，超聲3-4次）；

超聲破碎完成后，離心（4℃，12000rpm離心30分鐘）；

離心完成后，用移液器吸取上清液至新的EP管中，同時記錄蛋白提取液的體積，然后用BCA法測上清蛋白的濃度。

組織勻漿液的蛋白定量必要性

為了避免假陽性的產(chǎn)生

ELISA檢測指標(biāo)眾多，某些組織樣本如肝臟，腎臟，腦組織等，因為細胞內(nèi)含有的蛋白復(fù)雜多變，可能會造成與檢測指標(biāo)有假陽性反應(yīng)。所以通過蛋白含量檢測，把高濃度（20mg/mL以上）的樣本進行稀釋至1-2mg/mL，進行判斷是否存在假陽性的可能；

為了方便后續(xù)的數(shù)據(jù)處理和比較分析

因為組織塊的大小、提取蛋白的效率不同，所以必然提取的組織勻漿液中蛋白含量在一定的范圍內(nèi)變化，或者樣本間蛋白含量差異顯著。這些都會造成后續(xù)數(shù)據(jù)處理的困難，無法分辨是因為研究處理的影響，還是蛋白含量造成的差異性。因此，大多數(shù)學(xué)者會繼續(xù)發(fā)掘數(shù)據(jù)的其余方面，例如，處理組與對照組的含量百分比；每克組織勻漿蛋白中細胞因子含量的比較；聯(lián)用其余指示性指標(biāo)進行比較，例如，炎癥反應(yīng)級別、脂肪率、模型差異等進行聯(lián)合比較分析。

組織勻漿液進行細胞因子檢測的思考

因為目前檢測細胞因子的類型越來越多，我們也要重新考慮樣本處理適合自己的樣本類型，并且適合自己檢測的細胞因子類型，例如，檢測因子有可能為蛋白酶3（Protease 3）、核糖核酸酶A（核糖核酸酶A）、中性粒細胞彈性蛋白酶（NE/ELA2）等具有酶活性質(zhì)的細胞因子，在組織勻漿過程中是否添加蛋白酶抑制劑就值得思考；

一些檢測細胞因子需要酸化激活處理也需要特別注意，例如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、肌肉生長抑制素（GDF-8）等，因此在組織勻漿液的pH最好處于6.5-7.5的中性范圍；

以上我們介紹的方法只是比較通用的方法學(xué)。最后，我們作為科學(xué)研究使用，還是需要更多的參考具有代表性、可靠文獻中所述的處理方法，避免因為自己樣本處理的方式不對，造成ELISA檢測的失敗，影響檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和真實性。