ACE2是介導(dǎo)新冠病毒侵入的受體。然而，新冠病毒也被發(fā)現(xiàn)可以侵染ACE2陰性細(xì)胞，這意味著“狡猾”的新冠病毒還可能存在其他受體。
早前，有文章使用CRISPR基因篩選方法發(fā)現(xiàn)TMEM106B（與大腦衰老有關(guān)的膜蛋白）是潛在的新冠病毒受體。而比利時(shí)魯汶大學(xué)和英國弗朗西斯·克里克研究所使用X射線晶體技術(shù)、低溫電子顯微鏡（cryo-EM）、氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）以及賽多利斯的Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)和Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)等方法，從TMEM106B/S蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析角度進(jìn)一步闡釋了TMEM106B與新冠病毒結(jié)合的分子機(jī)理[1]，并發(fā)表于近期的《CELL》雜志上。
圖1. TMEM106B/S蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)TMEM106B結(jié)合S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域，其中S蛋白上的484位Asp以及TMEM106B的LD（管腔結(jié)構(gòu)閾）的Met210/Phe213是結(jié)合界面上的重要氨基酸殘基
那么兩者的親和力如何呢？上Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)!
圖2. Octet® 數(shù)據(jù)：將TMEM106B固化在NTA傳感器上，與13.5 μM的S1蛋白結(jié)合解離
結(jié)果顯示，TMEM106B與S蛋白有著明顯的結(jié)合，但是TMEM106B突變M210和F210位點(diǎn)后，就沒有結(jié)合了，數(shù)據(jù)證實(shí)了復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析的結(jié)論。
最近出現(xiàn)的比利時(shí)毒株的S蛋白484位為天冬氨酸（D484），而最初毒株為谷氨酸（E484）。用Octet® 檢測發(fā)現(xiàn)，D484的S蛋白親和力比E484強(qiáng)，也解釋了D484的侵染性更強(qiáng)的原因。
圖3. Octet® 數(shù)據(jù)：將TMEM106B固化在NTA傳感器上，與不同濃度的S1蛋白結(jié)合解離
TMEM106B結(jié)合S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域也是ACE2的結(jié)合區(qū)域，那么ACE2會(huì)不會(huì)與TMEM106B競爭結(jié)合S蛋白呢？
圖4. Octet® 數(shù)據(jù)：將TMEM106B固化在NTA傳感器上，與加入ACE2和不加ACE2的S蛋白結(jié)合，加入ACE2后沒有結(jié)合，說明ACE2與TMEM106B競爭結(jié)合S蛋白
Octet® 的一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果在分子水平上驗(yàn)證了復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析的結(jié)果。但是，如何在細(xì)胞學(xué)水平上證實(shí)TMEM106B與S蛋白的結(jié)合呢？是時(shí)候發(fā)揮Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)的威力了！
文章進(jìn)行了細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)：通過ACE2或TMEM106B、S蛋白（帶綠色熒光）轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，使其在表面表達(dá)這些蛋白；如果TMEM106B與S蛋白發(fā)生結(jié)合，細(xì)胞可以融合形成更大的細(xì)胞團(tuán)。
圖5. Incucyte® 實(shí)時(shí)成像結(jié)果：（左）細(xì)胞融合成像；（右）每隔3個(gè)小時(shí)拍攝一次，計(jì)算>1000 μm2的對象熒光面積總和，并做實(shí)時(shí)圖譜；結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染ACE2或TMEM106B細(xì)胞可以融合，但是TMEM106B突變M210和F210后無法實(shí)現(xiàn)融合
總結(jié)
距離新冠病毒被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有三年多的時(shí)間了，雖然許多人早已經(jīng)歷過兩次“陽”性，但我們依然不能高枕無憂，新冠病毒仍有可能卷土重來。因此，對它的侵染機(jī)理進(jìn)行研究仍然是至關(guān)重要的，只有進(jìn)行更多的基礎(chǔ)研究，才能為藥物研發(fā)指明方向。該文作者以TMEM106B為靶點(diǎn)篩選到一些抗體，并發(fā)現(xiàn)這些抗體能阻止新冠病毒對細(xì)胞的侵染。雖然也有其他文章發(fā)現(xiàn)了除ACE2外的其它新冠病毒受體，但該文不僅結(jié)合多種手段對復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，而且用Octet®、Incucyte® 等手段進(jìn)行了驗(yàn)證，因此，可信度很高，這也是本文能夠被CELL收錄的原因之一。
為什么越來越多的文章
都使用了Incucyte® 呢？
培養(yǎng)箱內(nèi)可長達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細(xì)胞的傷害；這篇文章每隔3個(gè)小時(shí)拍攝，連續(xù)拍攝3天
6個(gè)板位，分別獨(dú)立設(shè)置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高
高效簡便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標(biāo)多參數(shù)；本文提到了使用Incucyte® 通過設(shè)置熒光目標(biāo)面積大小對一些未融合的細(xì)胞進(jìn)行過濾，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確
大于100種優(yōu)化過的活細(xì)胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol，文章數(shù)大于14000篇，是長時(shí)間活細(xì)胞成像產(chǎn)品中的佼佼者
為什么越來越多的文章
都使用了Octet® 呢？
非標(biāo)記Direct Binding是趨勢，它的結(jié)果更準(zhǔn)確
快速測定親和力，更加定量化對互作進(jìn)行表征
無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）；本文的結(jié)合就是典型的快解離
測試時(shí)間短，一般10-20分鐘，更快拿到結(jié)果
實(shí)驗(yàn)形式多樣化：定性，兩者結(jié)合，協(xié)同/競爭實(shí)驗(yàn)，垂釣
寫入美國藥典，文章>13,000篇，認(rèn)可度廣
萬金油技術(shù)，可以用與檢測DNA、小分子、蛋白等各種生物分子
使用方便，成本相對低
下載文檔
下載《生物層干涉技術(shù)應(yīng)用文集—病毒學(xué)基礎(chǔ)研究與藥物研發(fā)》，了解如何對病毒的致病機(jī)理在結(jié)構(gòu)與分子水平上進(jìn)行深入的研究，分析病毒蛋白與宿主受體蛋白，病毒核酸與聚合酶等相關(guān)作用機(jī)制，從而找到關(guān)鍵的“解密之匙”。
參考文獻(xiàn)
[1] TMEM106B is a receptor mediating ACE2- independent SARS-CoV-2 cell entry.Cell,2023
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