細(xì)胞株開發(fā)簡述：
可靠生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)
近年來，全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展正處于快速上升期，醫(yī)藥健康行業(yè)也將迎來新一輪的變革與機(jī)遇。其中，細(xì)胞與基因治療藥物、抗體藥物書寫創(chuàng)新生物藥新篇章，被認(rèn)為是未來醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的主力軍。但無論是抗體藥物的生產(chǎn)還是基于病毒載體的基因治療藥物的制備，都離不開穩(wěn)定高效的細(xì)胞株開發(fā)。
▲ Global Market Insights數(shù)據(jù)預(yù)測：CLD市場報(bào)告[1]
據(jù)Global Market Insights數(shù)據(jù)預(yù)測，CLD市場規(guī)模在2021年約為58億美元，預(yù)計(jì)從2022年到2028年將以每年約10.1%的復(fù)合年增長率增長，到2028年將達(dá)到約117億美元。
CLD作為生物藥CMC的起點(diǎn)和基礎(chǔ)，構(gòu)建一個(gè)適合于生產(chǎn)的高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株至關(guān)重要，因?yàn)槠湓诤艽蟪潭壬蠜Q定了藥物開發(fā)的效率和成本。
CLD與古法造紙過程類似，成本昂貴、耗時(shí)長，開發(fā)流程如同雕版印刷中的勾刻印繪裱，每個(gè)步驟都涉及復(fù)雜而精細(xì)的生物分析和質(zhì)量研究工作，并且需要優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)工藝，以確保能夠成功進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)。
在CLD早期工藝開發(fā)階段增強(qiáng)對(duì)未來潛在挑戰(zhàn)的認(rèn)識(shí)有助于降低失敗風(fēng)險(xiǎn)，減少重復(fù)工藝相關(guān)費(fèi)用，并確保最終的生物藥滿足監(jiān)管要求。目前，CLD面臨著一些技術(shù)上的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，例如大批量克隆篩選、早期表征分析和優(yōu)化以及可擴(kuò)展性、細(xì)胞株穩(wěn)定性等。
面對(duì)不同的生物藥開發(fā)，如何實(shí)現(xiàn)高效、高質(zhì)量的CLD？在工藝上又可以通過哪些手段或方案來滿足預(yù)期的商業(yè)化需求？下面就讓小編給大家細(xì)細(xì)道來。
不斷優(yōu)化的技術(shù)流程
自漢朝發(fā)明紙張以后，書寫材料比起過去用的甲骨、簡牘、金石和縑帛要更輕便、更經(jīng)濟(jì)，但流程仍復(fù)雜，成本較高，雕版印刷技術(shù)的出現(xiàn)改變了這一現(xiàn)狀，標(biāo)準(zhǔn)化雕刻了反體字的模板與近乎透明的稿紙正面相貼，大大提升了原始手抄經(jīng)書的速度，且筆畫清晰可辨。
目前CLD的標(biāo)準(zhǔn)流程步驟包括：基因克隆和初始克隆篩選、克隆篩選和驗(yàn)證分析、細(xì)胞培養(yǎng)及培養(yǎng)基優(yōu)化、評(píng)估和表征分析以及最后的細(xì)胞庫建立。整個(gè)開發(fā)周期一般需要12-18個(gè)月，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化流程中的每一步工藝改進(jìn)都將影響CLD整體進(jìn)程。
▲ 高效細(xì)胞株開發(fā)工藝流程
1、初始克隆篩選——全流程開發(fā)的基石
雕版印刷術(shù)的第一步是選擇合適的木板，厚度和硬度都是成功的關(guān)鍵屬性，而CLD的第一步需要考慮采用何種表達(dá)體系。
宿主細(xì)胞系直接影響產(chǎn)品的特定屬性，比如糖基化、羧基化、羥基化、酰胺化等；甚至還可能影響半衰期、免疫原性和生物學(xué)活性。宿主細(xì)胞系應(yīng)有完整表征以及完整的記錄，并不含TSE/BSE等病毒污染因f素。另外，宿主細(xì)胞還應(yīng)適合無血清培養(yǎng)基，或者無動(dòng)物來源成分的培養(yǎng)基中懸浮生長。
近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展以及研究的深入，有超過75.6%的生物藥采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系，其包括人源細(xì)胞和非人源細(xì)胞，其中在這部分里有超過83%的生物藥采用了非人源細(xì)胞系的CHO(Chinese hamster ovary)細(xì)胞進(jìn)行CLD。
▲ 2014-2020年獲批的生物制劑應(yīng)用的細(xì)胞表達(dá)體系比例
據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2015年后獲批的藥物中，CHO細(xì)胞表達(dá)體系占據(jù)超過一半的比例。主要原因有三點(diǎn)：
CHO細(xì)胞在生物藥生產(chǎn)中應(yīng)用早、表達(dá)量高、容易處理和操作以及法規(guī)接受程度高；
CHO細(xì)胞還具有較高的基因和表型不穩(wěn)定性，有著較多的細(xì)胞譜系，例如DG44、DXB11、CHO K1、CHO-S等；
致病性的病毒在CHO細(xì)胞中無法復(fù)制，因此CHO細(xì)胞被認(rèn)為是非常安全的表達(dá)體系。
此外，初始克隆階段能夠以快速度鑒定細(xì)胞活力，從數(shù)以千計(jì)的克隆中找到穩(wěn)定、高產(chǎn)的克隆將為后續(xù)流程奠定基礎(chǔ)。
Octet®分子互作分析系統(tǒng)采用生物層干涉（BLI）技術(shù)，是一種無標(biāo)記的、實(shí)時(shí)監(jiān)測的技術(shù)，主要用于生物分子間相互作用動(dòng)力學(xué)參數(shù)及蛋白濃度測定。使用Octet®，能夠?qū)兓臉悠泛彤愘|(zhì)的粗樣品裂解液中的IgG 濃度進(jìn)行量化，最多可選96通道，10分鐘內(nèi)檢測一塊384孔板。
2、目標(biāo)蛋白表達(dá)——多方向考量與調(diào)整
從技術(shù)層面上分析，印刷術(shù)采用的字模材料主要是木和泥，經(jīng)過多次使用，排字行距就變得歪斜不整齊。再加上本來字模手工雕刻導(dǎo)致的字體、大小、筆畫粗細(xì)不一，失誤導(dǎo)致的字體顛倒、錯(cuò)字等，因此需要選擇合適的墨水和雕刻手法。
CLD的開發(fā)同樣如此，在選擇好合適的表達(dá)體系后，下一步的關(guān)鍵是讓核酸進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)目的蛋白——轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染是一種重要的重組DNA技術(shù)，其可將編碼目的蛋白產(chǎn)物基因與表達(dá)載體結(jié)合并插入細(xì)胞基因組。其中，載體是能夠自主復(fù)制的DNA元件。載體中不僅包含轉(zhuǎn)入的外源基因，還包括一些用于優(yōu)化蛋白質(zhì)表達(dá)過程和緩解沉默效應(yīng)的表達(dá)元件。選擇標(biāo)記基因的主要目的是加快遺傳載體在宿主細(xì)胞系中的表達(dá)。用于CHO細(xì)胞的經(jīng)典選擇標(biāo)記包括谷氨酰胺合成酶（GS）和二氫葉酸還原酶（DHFR）。
▲ 生物分子的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染流程（圖片來源：參考資料3）
目前轉(zhuǎn)染方法包括基于試劑的方法、基于儀器的方法和病毒介導(dǎo)法：
這里，應(yīng)該注意的是，沒有一種方法適用于所有的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)，在選擇轉(zhuǎn)染方法時(shí)，需要考慮細(xì)胞類型、產(chǎn)品表達(dá)量需求、安全性、經(jīng)濟(jì)性、工藝放大、周轉(zhuǎn)時(shí)間和法規(guī)要求等多方面因素。理想的方法應(yīng)具有高轉(zhuǎn)染效率，低細(xì)胞毒性和對(duì)正常生理學(xué)的影響最小，并且易于使用和具有可重復(fù)性等特點(diǎn)。目前常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法有磷酸鈣法、陽離子脂質(zhì)體法、病毒轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。
另外，在轉(zhuǎn)染過程中，化學(xué)限定的細(xì)胞培養(yǎng)基已經(jīng)成為當(dāng)下CHO細(xì)胞生產(chǎn)工藝的金標(biāo)準(zhǔn)。
在有關(guān)CHO培養(yǎng)基和克隆篩選方法的對(duì)比分析的研究中，研究人員運(yùn)用培養(yǎng)基基準(zhǔn)測試并充分利用Ambr® 15微型生物反應(yīng)器平臺(tái)進(jìn)行克隆/培養(yǎng)基各種組合的培養(yǎng)基篩選，在相同大小、多并行的生物反應(yīng)器中比較培養(yǎng)物，建立多個(gè)實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)不同的細(xì)胞系或克隆，并研究工藝參數(shù)的影響，例如溫度、補(bǔ)料、培養(yǎng)基成分、通氣量和接種密度。
并使用Octet®非標(biāo)記分子互作分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行滴度、結(jié)合活性以及糖基化分析等一系列檢測。
結(jié)果顯示結(jié)果顯示，4Cell® XtraCHO培養(yǎng)基，在細(xì)胞生長、存活率、產(chǎn)量、糖基化分析方面，性能優(yōu)于對(duì)照組培養(yǎng)基（詳見文章：高效細(xì)胞株開發(fā)：高通量細(xì)胞培養(yǎng)及滴度測定）。
3、細(xì)胞篩選和評(píng)估
雕版印刷肇始于隋，行于唐世，在不斷使用過程中人們逐漸發(fā)現(xiàn)其局限性，那就是發(fā)現(xiàn)錯(cuò)別字時(shí)改起來很困難，常需整塊版重新雕刻，因此活字印刷術(shù)被發(fā)明，大大地加快了精準(zhǔn)度和制版時(shí)間。現(xiàn)代CLD細(xì)胞培養(yǎng)的過程中同樣能夠通過高通量分析和篩選技術(shù)精準(zhǔn)、高效地發(fā)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞，并為下游工藝未雨綢繆。
通常，細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后最終的生產(chǎn)克隆中會(huì)整合幾十到數(shù)千個(gè)目的基因拷貝，所以很難確定整合的質(zhì)粒數(shù)是否可以達(dá)到預(yù)期的最佳值。而且，目的基因會(huì)選擇性標(biāo)記在宿主細(xì)胞基因組中以隨機(jī)方式進(jìn)行穩(wěn)定整合，故無法準(zhǔn)確預(yù)測整合效果。因此，按照此流程選擇的Minipool實(shí)際上是異質(zhì)的混合細(xì)胞群體，這些細(xì)胞在整合轉(zhuǎn)基因的數(shù)量和定位方面可能有明顯差異，故細(xì)胞比生產(chǎn)率（Qp）也可能各不相同。
為了提高高表達(dá)細(xì)胞出現(xiàn)的概率，可以采用“批量分揀法”富集穩(wěn)定高產(chǎn)的Minipool。由于早期Minipool的蛋白分泌較少，富集在上清里面的蛋白含量極低，故傳統(tǒng)方法在速度及數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度上都難以實(shí)現(xiàn)。
iQue®高通量流式細(xì)胞儀能夠快速監(jiān)測細(xì)胞健康和活力，使用人IgG滴度和活力分析試劑盒可以很好地評(píng)估懸浮CHO細(xì)胞，同時(shí)定量測定其分泌蛋白，以快速識(shí)別先導(dǎo)克隆，在短時(shí)間內(nèi)增加克隆評(píng)估數(shù)量，5分鐘內(nèi)完成一塊96孔板檢測。
ForeCyt®軟件上的Panorama功能具有動(dòng)態(tài)多板數(shù)據(jù)分析能力，包括可以用戶自定義標(biāo)準(zhǔn)的圖譜，用于檢測和識(shí)別包含所需IgG同種型抗體濃度和細(xì)胞健康的樣品，這在多板篩選分析時(shí)非常重要。小鼠IgG亞型和產(chǎn)量檢測能夠簡化和加速抗體發(fā)現(xiàn)的工作流程，這意味著更短的時(shí)間獲得更多的分析結(jié)果。具體而言，將穩(wěn)定的Minipool與采用熒光標(biāo)記的親和分子或特異性抗IgG抗體一起孵育，以表征細(xì)胞表面上分泌的重組蛋白量，從而能夠識(shí)別和富集高產(chǎn)Minipool。
由于監(jiān)管機(jī)構(gòu)僅接受采用單克隆細(xì)胞生產(chǎn)生物藥，這意味著生產(chǎn)所用細(xì)胞必須是從單個(gè)細(xì)胞克隆而來的均一細(xì)胞，因此需要進(jìn)一步對(duì)Minipool進(jìn)行單克隆化和選擇適于大規(guī)模生產(chǎn)的克隆。
4、單細(xì)胞克隆
活字印刷術(shù)由于手工制作的原因，單字之間存在個(gè)體差異，經(jīng)過篩選出來的Minipool同樣存在這類問題甚至更加嚴(yán)重，可能其中的每個(gè)細(xì)胞都具有特別的遺傳和表型特征。
單克隆性不足可能引發(fā)一些問題，例如：生長速率、代謝特征、重組蛋白Qp穩(wěn)定性、產(chǎn)品質(zhì)量等方面的差異。若Minipool由生長速率（μ）和Qp有微小差異的細(xì)胞組成，則μ高的低產(chǎn)Minipool將逐漸在數(shù)量上超過μ低的高產(chǎn)細(xì)胞群。據(jù)報(bào)道，這種情況下僅9%的生長優(yōu)勢(shì)便足以使細(xì)胞在25代內(nèi)出現(xiàn)過度增殖，這意味著工業(yè)生產(chǎn)必需采用基因和表型方面高度均一化的單克隆。
因此，需要采用先進(jìn)的技術(shù)手段以該類Minipool的單個(gè)細(xì)胞為起點(diǎn)進(jìn)行克隆，以確保生產(chǎn)用的所有細(xì)胞均來自單個(gè)細(xì)胞。對(duì)選定的Minipool進(jìn)行克隆、培養(yǎng)和評(píng)估，在多次迭代選擇之后，最終的細(xì)胞庫由具有相同遺傳學(xué)特征的細(xì)胞（克隆群體）組成。目前，常用的細(xì)胞單克隆方法包括但不限于以下四種：傳統(tǒng)的有限稀釋法（LDC）、基于熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)（FACS）、高通量自動(dòng)化顯微技術(shù)、自動(dòng)化克隆系統(tǒng)等。
作為LDC或FACS單細(xì)胞分選技術(shù)的主要替代方法，CellCelector平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)高精度、高通量的單細(xì)胞及克隆篩選。通過結(jié)合高精度的機(jī)械臂技術(shù)及優(yōu)化的采集模塊，能夠自動(dòng)進(jìn)行排序及篩選，實(shí)現(xiàn)基于圖像的單克隆性證明和克隆活力評(píng)估，同時(shí)準(zhǔn)確分離出完整的高活率單細(xì)胞、貼壁克隆等，提高CLD效率。
此外，因?yàn)樯婕爱a(chǎn)品的安全性，細(xì)胞的單克隆源性驗(yàn)證在確保生物制藥產(chǎn)品的純度和均一性上至關(guān)重要，因此FDA的政策和法規(guī)都強(qiáng)制要求生物制藥企業(yè)提供清晰圖片證據(jù)，用以證明單克隆生物藥研發(fā)過程中的單克隆源性。
▲ 克隆篩選（圖片來源：參考資料5）
另外，早期克隆篩選的通量很高，因此必須有一個(gè)運(yùn)行非常平穩(wěn)和高效的優(yōu)化過程，包括細(xì)胞計(jì)數(shù)和滴度測定的適當(dāng)方法，而這些方法都需與高通量兼容。這意味著必須確保篩選了足夠數(shù)量的克隆，才能得到真正想要的類型。
Octet®分子互作分析系統(tǒng)不僅能夠快速定量粗提物中的蛋白，而且擁有針對(duì)檢測ProteinA、HCP殘留、唾液酸含量以及甘露糖含量的商業(yè)試劑盒，用戶可以在早期CLD階段快速篩選出高質(zhì)量細(xì)胞株，也可以在Octet®系統(tǒng)上輕松開發(fā)項(xiàng)目所需的高靈敏度定量分析方法。
接下來，完成克隆篩選后，需要進(jìn)一步驗(yàn)證生物藥產(chǎn)品的生物活性、功效及關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），這些關(guān)鍵信息將為下一步實(shí)驗(yàn)開展及工藝開發(fā)提供重要指導(dǎo)。Octet®分子互作分析系統(tǒng)可以進(jìn)一步對(duì)生物藥產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）進(jìn)行評(píng)價(jià)，得到優(yōu)單克隆細(xì)胞株。
5、細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)基優(yōu)化
挑選到理想的高表達(dá)克隆后，就要開始選擇商業(yè)化培養(yǎng)基或者定制培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化。高通量、標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化的細(xì)胞培養(yǎng)和工藝優(yōu)化能幫助我們?cè)讷@得更準(zhǔn)確結(jié)果的同時(shí)加速細(xì)胞株開發(fā)進(jìn)度。
另外，在生物藥項(xiàng)目開發(fā)之初及時(shí)采用自動(dòng)化和高通量平臺(tái)，還能以可追溯的方式簡化優(yōu)化策略，通過促進(jìn)多個(gè)參數(shù)的平行評(píng)估，使得從研究規(guī)模到商業(yè)規(guī)模的條件保持一致，顯著提高細(xì)胞株開發(fā)效率。
傳統(tǒng)的搖瓶培養(yǎng)篩選方法，因?yàn)闊o法提供一個(gè)良好穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，導(dǎo)致工藝放大性差，頻繁出現(xiàn)錯(cuò)篩和漏篩的情況，最終產(chǎn)生大量無效重復(fù)的工作，在一定程度上延長了CLD周期，Ambr®15高通量微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)，采用與玻璃罐反應(yīng)器相似的物理設(shè)計(jì)以及配套的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，可以高效準(zhǔn)確獲取克隆的真實(shí)性能。
6、評(píng)估和表征分析
在整個(gè)生藥物開發(fā)過程中，應(yīng)持續(xù)對(duì)抗體進(jìn)行表征分析，以確保滿足生物安全法規(guī)，并確保產(chǎn)品的性能符合預(yù)期。
Octet®BLI系統(tǒng)作為高通量非標(biāo)記分子互作平臺(tái)，不僅可以進(jìn)行滴度檢測，還可以對(duì)抗體進(jìn)行一系列的表征分析，提供詳細(xì)的表征分析說明書，加快藥物申報(bào)上市的速度。
除此之外，還需對(duì)所選細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)格細(xì)致的測試，以保證其遺傳穩(wěn)定性，并確保其不含任何病原體及其它未知因子。
Summary
從雕版到活字，印刷術(shù)的發(fā)展為CLD流程開發(fā)提供了直接的經(jīng)驗(yàn)性啟示。未來仍需要在發(fā)展的過程中不斷優(yōu)化CLD的流程。除了采取不同的優(yōu)化策略，穩(wěn)定高效的CLD還需要開發(fā)更加先進(jìn)設(shè)備。不久前，賽多利斯發(fā)布了有關(guān)CLD的白皮書，其概述了CLD工藝流程以及生物制藥公司在建立CLD流程時(shí)面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)和優(yōu)化策略，以幫助有CLD需求的生物制藥公司了解更多工藝細(xì)節(jié)。
-參考文獻(xiàn)-
https://www.gminsights.com/industry-analysis/cell-line-development-market-report
https://www.researchgate.net/publication/291950333_Challenges_of_glycosylation_analysis_and_control_An_integrated_approach_to_producing_optimal_and_consistent_therapeutic_drugs
https://www.researchgate.net/publication/350861457_Recent_advances_in_CHO_cell_line_development_for_recombinant_protein_production
張愛龍《提升高產(chǎn)細(xì)胞株篩選效率，助力基因治療、抗體藥物等工藝開發(fā)——單細(xì)胞打印機(jī)（附案例分享）》
孤毒藥師《CMC基石：生物制劑生產(chǎn)中的細(xì)胞株開發(fā)流程》
Biopharmaceutical Processing: Development, Design, and Implementation of Manufacturing processes. Günter Jagschies, Eva Lindskog, Karol ??cki, Parrish Galliher. 2018
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