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Anika Manzke是病毒清除產(chǎn)品經(jīng)理，Birte Kleindienst是病毒清除產(chǎn)品初級經(jīng)理，二人均供職于Sartorius Stedim Biotech

細菌、支原體和病毒等各種感染因子對生物反應器的污染會對患者安全構成潛在的威脅。近年來，病毒一直是導致多種生物反應器污染的原因（1）。許多生物制藥公司已經(jīng)報告過鼠細小病毒（MVM）或皰疹病毒屬（2）等無包膜細小病毒對生產(chǎn)級生物反應器造成的污染。制藥行業(yè)中的許多重量級公司都加入了CAACB來共同解決這一問題。

制造商可以采取多種方法降低細菌或支原體引起的細胞培養(yǎng)污染風險。但是，病毒（特別是無包膜細小病毒）引起的污染風險，即使是在使用化學限定培養(yǎng)基（1）的情況下，對生物制藥行業(yè)而言仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的除菌級過濾器,即使是0.1微米的過濾膜都不能防止無包膜微小病毒造成的污染。

病毒污染比細菌污染（3）更難以檢測。未能檢測到的病毒可能會污染整個下游過程，甚至是終藥品。許多公司因鼠細小病毒或皰疹病毒屬（2）污染而遭受了生產(chǎn)損失。針對所有上述情況，根源分析顯示，可能的源頭是在供應鏈（4-6）早期儲存過程中的培養(yǎng)基組分（如鹽）污染。

圖1：病毒污染事件的逐漸升級關聯(lián)效應

防止老鼠進入這些倉庫的措施不夠充分。

這些污染事件可能對患者造成致命的后果。 

這些無包膜病毒的穩(wěn)定性高，因此它們可以長期存活。即使是一個感染性顆粒也會污染整個生物反應器。這一個顆粒會在生物反應器中迅速復制。在它進入生物反應器之前，要在1000 L的培養(yǎng)基中找出這一個顆粒無異于大海撈針。

 污染影響

這種污染事件可能對患者造成致命的后果（參見圖1）。如果公司發(fā)現(xiàn)存在污染，不僅需要關閉工廠，還需要進行大量的清潔工作。由此便可能導致藥物短缺，患者不能獲得救生藥物（7）。

上游病毒清除解決方案

上游工藝中需要有新的病毒清除理念。

過去，研究人員已經(jīng)研究了伽馬輻射、UV-C照射或高溫短時處理（HTST）等技術去除細胞培養(yǎng)基病毒的能力。如牛血清在伽馬照射下能清除大部分的病毒（8）。高溫短時處理需要大量投資，因此它僅在高流速下處理大量培養(yǎng)基時才是經(jīng)濟可行的（9）。然而，并非所有培養(yǎng)基組分都是熱穩(wěn)定的，而高溫短時處理系統(tǒng)線性放大也并非易事。UV-C受限于可應用的流速，因此在制備大體積的培養(yǎng)基時應用有限。此外，從這些公開發(fā)布的方法數(shù)據(jù)來看，這些技術在滅活無包膜細小病毒方面的效果也良莠不齊。迄今為止，過濾這項有效的技術（對無包膜病毒特別有效）尚未被廣泛應用于培養(yǎng)基過濾（10）。

下游病毒過濾器的瓶頸

為達到理想的病毒清除效果，一些公司已經(jīng)采用下游工藝中的除病毒過濾器來進行培養(yǎng)基的過濾制備，以此盡量減少病毒污染的風險。因為生產(chǎn)時間長，流速低，所以公司可有效地將這些過濾器用于過濾灌注生物反應器的培養(yǎng)基中的潛在病毒。采用傳統(tǒng)的下游工藝（DSP）過濾器過濾化學限定培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的過濾載量相當高，能高達10.000 L/m²（11）。

如果可以在幾天內(nèi)而非數(shù)小時內(nèi)過濾這些培養(yǎng)基，傳統(tǒng)的DSP過濾器則是的解決方案，而且經(jīng)濟上可行，因為小過濾面積已經(jīng)足以滿足需求。然而，在傳統(tǒng)的批量過濾中，情況并非如此。由于細菌污染的風險，培養(yǎng)基必須在至少24小時內(nèi)過濾，且理想情況下是在一個班次內(nèi)。為了提高過濾的整體速度，則需要更大的過濾面積，但這種方法成本昂貴，在經(jīng)濟上不可行。

經(jīng)濟上的可行方案

生物制藥行業(yè)需要解決將下游工藝除病毒過濾器用于上游培養(yǎng)基除病毒過濾的低流速和高成本問題，使其在經(jīng)濟上可行。這是開發(fā)專門用于培養(yǎng)基過濾（10）的代病毒截留過濾膜的背景。

方法

截留性能

每個5.0cm²的實驗室用除病毒濾器都經(jīng)過了病毒挑戰(zhàn)實驗. 實驗采用了作為“差條件”下的非脂包膜指示病毒-MVM 。它是細小病毒家族的12-26納米單鏈無包膜ssDNA病毒。實驗使用5.0cm²的除病毒濾器，在2.0bar的恒定壓力下過濾3種不同的培養(yǎng)基，并進行二次重復實驗。在1%的病毒加入量下，過濾了400 L/m²。

膜載量測試

膜過濾載量采用了三個不同供應商的15種不同培養(yǎng)基來測定。所有測試均在2.0bar的恒壓下進行。

表1：新型除病毒培養(yǎng)基濾器的截留能力，實驗室用濾器（5 cm²）。

圖2：在4小時的過濾時間內(nèi)，15種細胞培養(yǎng)基（CCM）在恒壓2.0bar下的通過量一覽；培養(yǎng)基除病毒過濾器，實驗室用。

4小時過濾后對總過濾量進行了測量。

結果

截留性能

表1總結了使用新型膜進行測試的截留數(shù)據(jù)。膜的病毒截留性能同下游工藝應用中使用的過濾器相當。無包膜細小病毒MVM的截留量超過4個對數(shù)值。分析方法檢測不到濾液中的MVM。可合理預期該膜會截留比細小病毒更大的潛在污染因子。

不同化學限定成分細胞培養(yǎng)基的膜通過量

膜的通過量采用了三個不同供應商的15種培養(yǎng)基來測定。圖2表明了在2bar壓力下，4小時的培養(yǎng)基處理載量因培養(yǎng)基組分不同而差別很大。例如，Lonza Power CHO2相對較快地造成了膜堵塞，而Lonza ProPER1培養(yǎng)基似乎*不堵膜。

對于一些商業(yè)化細胞培養(yǎng)基，使用串聯(lián)0.1微米過濾器顯著提高了除病毒過濾膜載量（7）。但僅部分培養(yǎng)基可行，有些則沒起作用。諸如泊洛沙姆等保護劑大幅降低了過濾流速（10）。

對于一些商業(yè)化細胞培養(yǎng)基，使用串聯(lián)0.1微米過濾器顯著提高了膜通過量。

降低泊洛沙姆濃度或在添加至培養(yǎng)基以前過濾能大幅提高過濾器的過濾量。業(yè)界應該展開更多研究，從而充分了解不同培養(yǎng)基組分對培養(yǎng)基過濾器過濾性能的影響。根據(jù)本研究，可設計出一種既能改善過濾性能又不影響后續(xù)細胞培養(yǎng)工藝的培養(yǎng)基。不過，研究表明，在細胞培養(yǎng)基通常的4小時過濾中，開發(fā)的新膜通常過濾載量約1000 L/m²。因此，對于批量制備培養(yǎng)基，這種新膜是經(jīng)濟上可行的辦法，同時也降低了細胞培養(yǎng)基的病毒污染風險。

結論

在本文中，作者介紹了一種新的病毒截留膜，上游工藝工程師可使用它來過濾化學限定培養(yǎng)基，從而降低風險。此外，作者已經(jīng)證明該方法可截留4個Log以上的非包膜細小病毒。當過濾一系列不同型號的化學限定培養(yǎng)基時，該膜的通量較高，生物制藥公司能夠在上游工藝中使用這種膜，而且不會對工藝成本造成不利的影響。該膜有可能成為基于風險控制來zui大程度地降低病毒污染事件的重要環(huán)節(jié)，同時提高生物制藥公司的生產(chǎn)能力。

REFERENCES

1.P. W. Barone, PhD, “Lessons Learned from the Consortium on Adventitious Agent Contamination in Bio Manufacturing,” Viral Safety for Biologics, Cologne, June 21, 2016.

2. Bethencourt, Nature Biotechnology 27, 681 (2009), www.nature。。ｃｏｍ/nbt/journal/v27/n8/full/nbt0809-681a

3.O.-W. Merten, Cytotechnology 39, 91–116 (January 9, 2003).

4.M. Moody, PhD, “MMV Contamination–A Case Study: Detection, Root Cause Determination, and Corrective Actions,” PDA/FDA Adventitious Viruses in Biologics: Detection and Mitigation Strategies Workshop, Bethesda, Maryland, Dec. 1-2, 2010.

5.Jim Skrine, “A Biotech Production Facility Contamination Case Study–Minute Mouse Virus,” PDA/FDA Adventitious Viruses in Biologics: Detection and Mitigation Strategies Workshop, Bethesda, Maryland, Dec. 1-2, 2010.

6.Linda Hendricks, “Case Study of Apparent Virus Contamination in Biopharmaceutical Product at Janssen,” PDA/FDA Adventitious Viruses in Biologics: Detection and Mitigation Strategies Workshop, Bethesda, Maryland, Dec. 1-2, 2010.

7.B. Kleindienst, “Proof of Concept–The first virus retentive membrane for risk mitigation in upstream,” Viral Safety & Raw Materials for Biologics, Cologne, June 22nd, 2016.

8.G. Gauvin and R. Nims, PDA Journal, Vol. 64, No 5, 432-435, 2010.

9.B. Hansmann, V. Thom, A. Manzke, “Contamination Risk Mitigation in Cell Culture Media Preparation,” Virus & TSE Safety Forum, Lisabon, June 9-11, 2015.

10.A. Meyer, “Risk Mitigation in Media Preparation—Current Possibilities and Future Trends,” PDA Virus & TSE Safety Forum, Berlin, June 5, 2013.

Thomas R. Kreil, “Virus Safety—A Look into the Entire Process Raw Materials, Upstream, Downstream,” European Upstream and Downstream Technology Forum Goettingen, September 8-10, 2014. ◆

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