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引言

作為世界上小的細(xì)菌之一，支原體能夠獨(dú)立繁殖。它們屬于柔膜菌綱，生長(zhǎng)非常緩慢，且為寄生。細(xì)胞培養(yǎng)物的污染仍是一個(gè)主要問(wèn)題。一系列生理和生化參數(shù)受細(xì)胞培養(yǎng)物中支原體的影響。支原體感染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、活力、大分子合成、形態(tài)等發(fā)生變化，因此對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行靈敏的常規(guī)污染檢測(cè)是*的。

傳統(tǒng)的基于生長(zhǎng)的方法需要培養(yǎng)至少28天才能確定地排除支原體污染。相比之下，核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）可將獲得結(jié)果的時(shí)間縮短到幾個(gè)小時(shí)。作為培養(yǎng)法的一種替代方法，必須證明NAT測(cè)試系統(tǒng)能夠檢測(cè)10 CFU/mL的支原體。為此，本研究中對(duì)三種不同的支原體PCR試劑盒進(jìn)行了測(cè)試，測(cè)試其在DMEM培養(yǎng)基中檢測(cè)不高于10 CFU/ml支原體的能力。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置和結(jié)果

在本次研究中，使用Microsart^® AMP支原體試劑盒（包括樣品制備）和Microsart^® AMP提取試劑盒（Sartorius Stedim Biotech GmbH）和其他兩種支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了驗(yàn)證測(cè)試，這兩種檢測(cè)試劑盒也基于DNA分離和隨后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。使用10CFU靈敏度標(biāo)準(zhǔn)精氨酸支原體（NCTC編號(hào)10129）、口腔支原體（NCTC編號(hào)10112）和柑橘螺原體（NCTC編號(hào)10164）（Sartorius Stedim Biotech GmbH）作為測(cè)試材料。這些凍干標(biāo)準(zhǔn)品可以通過(guò)加入1 ml樣品基質(zhì)輕松再水化，達(dá)到10 CFU/ml的濃度。這些制劑旨在用于安全可靠地對(duì)支原體PCR分析進(jìn)行驗(yàn)證。在這些比較研究中，使用含有5% FCS的DMEM培養(yǎng)基作為樣品基質(zhì)。

對(duì)于全部三種測(cè)定，根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行DNA分離過(guò)程和隨后的PCR設(shè)定。Microsart^® AMP提取試劑盒基于方便的二氧化硅柱方案，可在30分鐘內(nèi)完成。競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品的DNA分離基于磁珠法使DNA沉淀。在評(píng)估的三種PCR檢測(cè)方法中，兩種包括高度特異性的TaqMan探針；其中之一是Microsart^® AMP支原體檢測(cè)試劑盒。第三種檢測(cè)方法的檢測(cè)混合物中含有SYBR Green，使得在DNA擴(kuò)增循環(huán)后需要進(jìn)行融解曲線分析，以區(qū)分非特異性擴(kuò)增DNA和支原體擴(kuò)增DNA。

每種樣品（精氨酸支原體、口腔支原體和柑橘螺原體）用每種試劑盒測(cè)試四次，包括DNA分離、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和數(shù)據(jù)分析的全過(guò)程。結(jié)果列于表1中。

表1：使用三家不同供應(yīng)商的試劑盒對(duì)DMEM培養(yǎng)基 + 5% FCS和10 CFU/ml 精氨酸支原體|口腔支原體|柑橘螺原體進(jìn)行PCR測(cè)試的結(jié)果

圖 1：使用Microsart^® AMP支原體試劑盒的擴(kuò)增曲線，使用精氨酸支原體樣品（10 CFU/ml，在DMEM培養(yǎng)基 + 5% FCS中），PCR Cycler MxPro 3005P

結(jié)論

在這些研究中，使用包括另外兩家供應(yīng)商支原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（包括樣品制備）對(duì)賽多利斯 Microsart^® AMP提取試劑盒和Microsart^® AMP支原體試劑盒進(jìn)行了驗(yàn)證測(cè)試。

在隨后的PCR分析中，36個(gè)DNA提取物均顯示陽(yáng)性信號(hào)。因此說(shuō)明所有測(cè)試產(chǎn)品都能以至少10 CFU/ml的靈敏度檢測(cè)支原體污染。

如果仔細(xì)觀察一家供應(yīng)商的結(jié)果中的標(biāo)準(zhǔn)偏差，首先使用Microsart^® AMP提取試劑盒，然后用Microsart^® AMP支原體試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，則會(huì)盡可能地減小結(jié)果的可變性，提高重現(xiàn)性。PCR試劑盒，主要是三種不同的樣品制備方法可能導(dǎo)致出現(xiàn)重現(xiàn)性差異。已知二氧化硅膜方法即使在處理高度復(fù)雜的樣品基質(zhì)時(shí)也非常穩(wěn)健和可靠。DNA沉淀法或磁珠法往往更費(fèi)力且不可靠。

另一個(gè)有助于Microsart^®支原體產(chǎn)品適用范圍可靠性的事實(shí)是，所有PCR試劑都可以儲(chǔ)存于4至8°C條件下。因此，如果冷鏈短暫中斷，不會(huì)導(dǎo)致試劑發(fā)生融化，否則會(huì)對(duì)PCR檢測(cè)的靈敏度產(chǎn)生負(fù)面影響。相反，供應(yīng)商T和供應(yīng)商R的支原體檢測(cè)試劑盒必須在-20°C冷凍保存。當(dāng)計(jì)劃用這些產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)試時(shí)，必須記住PCR試劑解凍的額外等待時(shí)間。此外，必須考慮如果必須在-20°C儲(chǔ)存的試劑盒在一次PCR運(yùn)行中未*用完，反復(fù)凍融也會(huì)對(duì)PCR結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。

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