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Hieff NGS^® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^®

(for 50 ng)

產品信息

產品描述

Hieff NGS^® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^® (for 50 ng)是針對lllumina^®高通量測序平臺專業(yè)開發(fā)設計的轉座酶法建庫試劑盒，適用于50 ng的基因組DNA、cDNA、擴增子（>500 bp）等樣本的建庫。與常規(guī)分步法建庫相比，Hieff NGS^® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^®采用新型轉座酶和優(yōu)化的緩沖體系，僅需10 min即可完成DNA  pian段化、末端修復和接頭連接過程，顯著縮短建庫時間至1.5小時以內，并獲得優(yōu)異的測序質量。此外，本試劑盒已經不同GC含量DNA樣本的驗證，無偏好性或僅具有極低的偏好性。本試劑盒提供的所有試劑盒組分，都經過嚴格的質量與功能驗證，zui高程度保障產品優(yōu)異性能與批間穩(wěn)定性。

產品組分

注意：*測序時Index序列N501-TAGATCGC，N701-TAAGGCGA，N702-CGTACTAG。

運輸與保存方法

冰袋運輸。所有組分-20°C保存，有效期1年。

注意事項

一、關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打或輕輕振蕩混勻，劇烈振蕩可能會造成文庫產出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。試劑吸取時應保證槍頭適當深入液體，排出時應確認槍頭無殘留。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

6. PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染，進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；使用的移液器等設備；并定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

二、關于產品原理

本產品基于轉座酶法開發(fā)，其核心原理是轉座酶及其轉座ji制。在Transposome Mix中包含由轉座酶和兩種等摩爾的接頭Adapter 1和Adapter 2構成一個完整的轉座子。轉座發(fā)生時，該轉座子將Adapter 1和Adapter 2接頭序列插入靶基因中，形成一端帶有Adapter 1，一端帶有Adapter 2的DNA，之后利用DNA聚合酶將轉座形成的切口補齊。這種產物經N5（N5XX）和N7（N7XX）以及P5和P7（PCR Primer Mix）兩對引物擴增，產物經分選和純化后即為可測序文庫。

圖1  Fast Tagment DNA建庫試劑盒原理

三、關于DNA  pian段化（DNA Tagment）

1. 本試劑盒使用轉座酶進行DNA  pian段化。如DNA樣品為PCR產物，應保證其長度>500 bp。因轉座酶無法作用于DNA末端，因此PCR產物末端50 bp測序覆蓋度可能會有所降低。我們推薦您在制備PCR產物時將待測區(qū)域兩末端各延長50-100 bp，以避免末端測序覆蓋度降低的情況。

2. 本試劑盒適用50 ng Input DNA。在Input DNA投入前，應將其純化并溶于滅菌蒸餾水中，A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0，并使用基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等進行定量?！咀⒁猓阂騎ransposome Mix對DNA濃度非常敏感，所以準確的DNA濃度測定對實驗成功與否至關重要。】

四、關于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

2. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

3. 轉移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質量。

4. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

5. 磁珠使用過程中，應保證移液準確性。

6. 產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長度分選產物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產物于4°C可保存1周，-20°C可保存1個月。

五、關于文庫擴增（Library Amplification）

1. 使用本試劑盒必須進行文庫擴增步驟。因轉座反應產物并非完整的雙鏈DNA文庫，必須通過PCR反應生成完整的DNA文庫。

2. 當Input DNA量為50 ng時，推薦使用5-9個擴增循環(huán)，7個循環(huán)的文庫產出約為900 ng。

六、關于文庫質檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產物、兩端均未連接Adapter的產物以及其他不完整雙鏈結構產物；qPCR定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

4. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產品。

2. 文庫質控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產品。

3. N5（N5XX）和N7（N7XX）Index引物： Hieff NGS^® Tagment Index Kit for Illumina^® (96 Index)（Cat#12610ES96）。

4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

圖2  Fast Tagment DNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 DNA pian段化（DNA Tagment）

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。將5×Reaction Buffer、6×Terminate Solution室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表1所示反應體系。

表1  片段化反應體系

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設置表2所示反應程序，進行片段化反應。

表2  片段化反應程序

5. 終止反應：立即向反應物中加入10 μL 6×Terminate Solution，使用移液器輕輕吹打混勻，短暫離心，55℃反應10 min，如表3。

表3  終止反應程序

6. 片段化產物純化

1）將平衡至室溫的Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠，振蕩或上下顛倒混勻，以1.0×比例回收上述片段化產物。

2）吸取60 μL磁珠加入上述60 μL片段化產物中，使用移液槍輕輕吹打混勻，室溫孵育5 min。

3）將PCR管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

4）保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后小心移除上清。

5）重復步驟4），總計漂洗兩次。

6）保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

7）將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL滅菌超純水洗脫。渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置孵育5 min。

8）將反應管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清（約5 min）后小心吸取20 μL上清至干凈的滅菌PCR管中。

7. 立即進行步驟3.2，文庫PCR富集。

3.2 文庫擴增（Library Amplification）

1. 將表4中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表4所示反應體系。

表4  PCR擴增反應體系

注意：*Hieff NGS^® Tagment Index Kit for Illumina^® (96 Index)（Cat#12610ES96）中提供8種N5XX和12種N7XX，可根據樣品數量和Index選擇策略自行選擇。

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表5所示反應程序，進行PCR擴增。

表5  PCR擴增反應程序

注意：*此步不可省略。轉座反應產物并非完整的雙鏈DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

**循環(huán)數請根據測序需要進行選擇。起始DNA量為50 ng時，推薦5-9個擴增循環(huán)。

3.3 文庫純化或分選（Library Clean Up/Size Selection）

如對文庫長度分布無特殊要求，可直接使用1.0×磁珠純化擴增產物（參照步驟3.1中6.片段化產物純化步驟），而不進行片段分選。如需進行片段分選，則進行以下步驟，推薦使用Cat#12601 DNA Selection Beads進行產物片段分選，為防止接頭或大片段殘留，可進行兩次片段分選，或先使用1.0×磁珠純化擴增產物后再進行分選。

1. 將平衡至室溫的Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠，振蕩或上下顛倒混勻。

2. 根據DNA  pian段長度要求，進行雙輪分選時，需將初始DNA樣本用滅菌蒸餾水補齊至100 μL，參考表6推薦比例向文庫上清中加入第—輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min。【注意：因PCR過程中樣品揮發(fā)會導致產物體積不足50 μL，進行下面操作之前必須使用滅菌蒸餾水將體積補齊至100 μL，否則分選長度會與預期不一致?！?/span>

表6  磁珠文庫分選推薦比例

注意：“×"數均根據PCR產物體積補齊至100 μL計算而得，如“0.6×"表示0.6×100 μL = 60 μL。

3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉移上清到干凈的離心管中。

4. 參考表6向上清中加入第二輪分選磁珠。

5. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

6. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

7. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

8. 重復步驟7，總計漂洗兩次。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

10. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

11. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉移20 μL上清至干凈的管中，于-20℃保存。此外，如需獲得長度分布更集中的文庫擴增產物，可使用膠回收方式進行長度分選和純化；如對文庫長度分布范圍等無特殊要求，擴增產物也可不進行長度分選，直接使用磁珠或柱純化試劑盒進行純化。

3.4 文庫質量控制

通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質量評價，具體請參見注意事項六。

3.5 參考實例

使用Hieff NGS^® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^®對50 ng嗜鹽桿菌gDNA樣本建庫，并分別使用1.0×磁珠進行純化，0.8×/0.2×、0.7×/0.2×、0.5×/0.15×磁珠比例進行長度分選，結果使用Agilent 2100 Bioanalyzer進行檢測。

圖3  Agilent 2100 Bioanalyzer文庫質量分析

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