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50107ES50總一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒（比色法）
| 參考價(jià): | 面議 |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)- 50107ES50 產(chǎn)品型號(hào)
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：3356更新時(shí)間：2023-03-15 09:46:15
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 貨號(hào) | 50107ES50 |
|---|---|---|---|
| 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品介紹
Total Nitric Oxide Assay Kit (Colorimetric)
總一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒（比色法）
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（元） |
Total Nitric Oxide Assay Kit (Colorimetric) 總一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒（比色法） | 50107ES50 | 50 T | 499.00 |
50107ES70 | 200 T | 1759.00 |
產(chǎn)品描述
總一氧化氮檢測(cè)試劑盒（Total Nitric Oxide Assay Kit, 即Nitrate/Nitrite Assay Kit）采用了硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase）還原硝酸鹽（nitrate）為亞硝酸鹽（nitrite），然后通過經(jīng)典的Griess reagent檢測(cè)亞硝酸鹽，從而測(cè)定出總一氧化氮。一氧化氮本身極不穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)很快代謝為硝酸鹽和亞硝酸鹽，通過上述方法檢測(cè)出所有的硝酸鹽和亞硝酸鹽的量，就可以推算出總的一氧化氮的量。
本試劑盒采用的是NADPH依賴性硝酸鹽還原酶（NADPH-dependent nitrate reductase）。高濃度的NADPH會(huì)干擾后續(xù)的檢測(cè)，因此在Griess Reagent檢測(cè)之前需要消除過量NADPH對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的干擾。乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase, LDH）是常用的NADPH消除試劑，通過其清除作用，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
本試劑盒具有以下特點(diǎn)。1）檢測(cè)靈敏度高：對(duì)亞硝酸鹽的檢測(cè)下限達(dá)到2 μmol/L，在2-80 μmol/L的范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。濃度過高的樣品可以適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)。2）適用范圍廣：能檢測(cè)各種樣品，包括細(xì)胞、組織、細(xì)胞或組織的培養(yǎng)液、血清、血漿或尿液等。3）抗干擾能力強(qiáng)：酚紅和10%血清對(duì)測(cè)定無明顯干擾。4）樣品用量少：僅需0-60 μL樣品，取決于樣品內(nèi)一氧化氮的濃度。5）檢測(cè)周期短：僅需約80 min即可完成檢測(cè)。
產(chǎn)品組分
編號(hào) | 組分 | 產(chǎn)品貨號(hào)（規(guī)格） | 保存方法 | |
50107ES50（50 T） | 50107ES70（200 T） | |||
50107-A | Assay Buffer 反應(yīng)緩沖液 | 15 mL | 15 mL | -20℃ |
50107-B | Enzyme Cofactor 反應(yīng)輔酶 | 5 mg | 5 mg | -20℃避光 |
50107-C | Enzyme Enhancer反應(yīng)增強(qiáng)子 | 550 μL | 1.1 mL×2 | -20℃ |
50107-D | Nitrate Reductase硝酸還原酶 | 250 μL | 1 mL | -20℃避光 |
50107-E | LDH Buffer LDH 緩沖液 | 550 μL | 1.1 mL×2 | -20℃ |
50107-F | LDH乳酸脫氫酶 | 500 μL | 1 mL×2 | -20℃ |
50107-G | Nitrite Standard亞硝酸鹽標(biāo)品（1 M） | 1 mL | 1 mL | -20℃避光 |
50107-H | Griess Reagent I Griess 試劑 I | 3 mL | 12 mL | -20℃避光 |
50107-I | Griess Reagent II Griess 試劑 II | 3 mL | 12 mL | -20℃避光 |
運(yùn)輸和保存方法
冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期一年。反應(yīng)輔酶配制成溶液后必須分裝并-70℃保存。
注意事項(xiàng)
1）含有較高濃度硝酸鹽的培養(yǎng)液，如RPMI 1640，易對(duì)本試劑盒的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，請(qǐng)盡量避免。必須使用RPMI 1640培養(yǎng)液時(shí)，在檢測(cè)一氧化氮前必需先換成其他適當(dāng)培養(yǎng)液如；DMEM、MEM、F12等，或HBSS或PBS緩沖液等。
2) 檢測(cè)反應(yīng)必須避光進(jìn)行。
3) 由于檢測(cè)過程中涉及還原反應(yīng)，因此影響還原反應(yīng)的氧化或還原試劑要注意避免，如還原劑DTT和巰基乙醇。
檢測(cè)步驟
1. 樣品處理
含有高濃度蛋白的樣品如血清、含有高濃度血清的細(xì)胞培養(yǎng)液等，在加入Griess Reagent I后可能產(chǎn)生沉淀?？扇?/span>50 μL樣品，加入50 μL Griess Reagent I進(jìn)行測(cè)試，觀察是否產(chǎn)生沉淀。如產(chǎn)生沉淀，可把樣品沸水浴加熱5 min，以變性蛋白，然后12,000 g離心5 min，取上清用于后續(xù)的測(cè)定。對(duì)于細(xì)胞或組織樣品可以使用無蛋白酶或者磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液進(jìn)行裂解。對(duì)于尿液樣品，通常需要用水稀釋10-50倍后檢測(cè)。不宜使用肝素抗凝的血漿，肝素抗凝的血漿在和Griess Reagent反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生沉淀。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品
用制備或者稀釋樣品所使用的溶液把1 M亞硝酸鹽標(biāo)品稀釋成 2、5、10、20、40、60、80 μmol/L。例如樣品為細(xì)胞裂解液，則用該裂解液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；樣品為細(xì)胞培養(yǎng)液，則用該培養(yǎng)液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。如果樣品為血清，則可以使用本試劑盒提供的反應(yīng)緩沖液（50107-A)或使用 PBS、生理鹽水等適當(dāng)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
3. 試劑的準(zhǔn)備
a. 加入約1 mL蒸餾水或MilliQ級(jí)純水至5 mg 反應(yīng)輔酶（50107-B）中，顛倒混勻溶解后，再用蒸餾水或MilliQ級(jí)純水定容至3 mL，配制成2 mM反應(yīng)輔酶溶液，除實(shí)驗(yàn)所需外，其余反應(yīng)輔酶溶液必須立即分裝后-70℃凍存。
b. 反應(yīng)增強(qiáng)子（50107-C）已經(jīng)配制在適當(dāng)溶液中。反應(yīng)增強(qiáng)子可以適當(dāng)分裝后-20℃或-70℃保存。
c. 硝酸還原酶（50107-D）和LDH（50107-F）在臨用前取出，并放置在冰浴上使用（注意在使用完畢后立即-20℃保存）。試劑盒中的其余各種試劑在溶解后保存在冰浴上。Griess Reagent I和Griess Reagent II在使用前需達(dá)到室溫。
4. 參考下表依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和檢測(cè)試劑并進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)：
| 空白對(duì)照 | 標(biāo)準(zhǔn)品 | 樣品 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | — | 60 μL | — |
樣品 | — | — | x μL |
用于樣品稀釋的溶液 | 60 μL | — | （60-x）μL |
反應(yīng)輔酶（2 mM） | 5 μL | 5 μL | 5 μL |
反應(yīng)增強(qiáng)子 | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
硝酸還原酶 | 5 μL | 5 μL | 5 μL |
混勻后，37℃孵育30 min | |||
LDH 緩沖液 | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
LDH | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
混勻后，37℃孵育30 min | |||
Griess 試劑 I | 50 μL | 50 μL | 50 μL |
Griess 試劑 II | 50 μL | 50 μL | 50 μL |
混勻后，室溫（20-30℃）孵育10 min后測(cè)定A540 | |||
【注】：a. 反應(yīng)必須避光進(jìn)行。如果使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，可以使用鋁箔紙包裹96孔板進(jìn)行避光。
b. 樣品的用量上限為60 μL，血清、血漿或組織勻漿液通常使用40 μL。樣品不足60 μL時(shí)，不同樣品之間的體積能保持*，體積不足的部分用用于樣品稀釋的溶液補(bǔ)足。用于樣品稀釋的溶液是指實(shí)際用于樣品稀釋的溶液或裂解樣品的溶液。標(biāo)準(zhǔn)品可以參考上表直接使用60 μL。
c. 可以同時(shí)設(shè)置加入200 μL水或PBS的2-3個(gè)孔為陰性對(duì)照，此2-3個(gè)孔只需加入水或PBS即可。
d. *部分37℃孵育30 min后，直接參考上表依次加入LDH緩沖液和LDH，并進(jìn)行后續(xù)孵育。
e. 第二部分37℃孵育30 min，直接參考上表依次加入Griess 試劑I和Griess 試劑 II。加入Griess試劑 I后需要輕輕混勻。
f. 每次混勻后，可以1000-3000 g離心數(shù)秒，把液體沉淀到管底。同時(shí)需避免各檢測(cè)孔中產(chǎn)生氣泡，以免氣泡干擾檢測(cè)結(jié)果。
g. 檢測(cè)時(shí)，如無540 nm濾光片，520-560 nm的濾光片也可以使用。如無酶標(biāo)儀或合適的濾光片，也可以通過數(shù)碼相機(jī)拍照后在適當(dāng)圖形軟件中進(jìn)行定量分析，并確定樣品中一氧化氮的濃度。拍照比色時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品需要更為精細(xì)的濃度梯度。
5. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算出樣品中一氧化氮的濃度。
常見問題
1. 檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但樣品的吸光度很低，和空白對(duì)照接近。
標(biāo)準(zhǔn)曲線良好說明檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒基本上沒有問題，樣品吸光度低說明樣品中一氧化氮含量很低?？梢圆扇〉霓k法是：（1）加大樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的使用量至60 μL，其余試劑用量不變。（2）把整個(gè)檢測(cè)體系每種試劑的用量加大50%，這樣可以使檢測(cè)靈敏度增加約50%。如果上述方法還不能解決問題，可以考慮濃縮樣品，即一方面在收集樣品的時(shí)候盡量使一氧化氮的濃度保持得較高（例如裂解細(xì)胞時(shí)采用較小體積的裂解液）；另一方面可以考慮用真空干燥或真空冷凍干燥的方法濃縮樣品。對(duì)于培養(yǎng)的細(xì)胞，通常上清液測(cè)定出來的吸光度相對(duì)較低，而細(xì)胞裂解液測(cè)定出來的吸光度會(huì)稍高一些。
2. 檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品的吸光度都非常高。
在使用RPMI 1640培養(yǎng)液時(shí)會(huì)發(fā)生這種情況。因?yàn)?/span>RPMI 1640培養(yǎng)液中含有高濃度的硝酸鹽從而會(huì)使樣品檢測(cè)出來的吸光度都非常高。其他含有高濃度硝酸鹽的試劑也會(huì)產(chǎn)生類似情況，影響氧化還原反應(yīng)的試劑也可能產(chǎn)生類似干擾。使用過程中避免使用RPMI 1640等可能導(dǎo)致干擾檢測(cè)的試劑即可。
HB171113
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