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層粘連蛋白521（Laminin 521）背景
層粘連蛋白521（LN521）是天然干細胞生態(tài)位的關(guān)鍵細胞粘附蛋白，是一種用于人胚胎（hES）和誘導多能干細胞（hiPSC）培養(yǎng)和擴增的基質(zhì)。LN521與細胞表面受體結(jié)合，激活細胞信號通路，從而產(chǎn)生更多功能性細胞。
Laminin 521在體外重現(xiàn)生物學相關(guān)的hPSC環(huán)境，促進hPSC的附著、高存活和強大的長期自我更新，是支持干細胞生長以及維持基底膜結(jié)構(gòu)和性能穩(wěn)定的關(guān)鍵基質(zhì)蛋白。Laminin 521也是目前常用的無滋養(yǎng)層培養(yǎng)基質(zhì)之一。此外，Laminin 521無需添加任何細胞凋亡抑制劑，即可實現(xiàn)遺傳穩(wěn)定和多能干細胞的高效單細胞傳代，細胞以均勻單細胞層生長，無需手動去除任何分化區(qū)域。另外，研究表明LN521可支持PSC生長超過10代，且無任何核型異常跡象，并且保持PSC分化為內(nèi)、中、外三個胚層的能力。
圖1.Laminin 521結(jié)構(gòu)[1]
層粘連蛋白包被實驗
用無菌去離子水或注射用水將層粘連蛋白521配制成400µg/ml。建議使用前用無菌1×DPBS（Ca++/Mg++）進一步稀釋至100µg/ml，然后用無菌DPBS（Ca++/Mg++）稀釋至工作濃度5-10µg/ml。包被濃度因培養(yǎng)細胞類型而異，建議實驗方案優(yōu)化以確定細胞的最佳包被濃度。推薦濃度請見表1。
注意：
應使用含有Ca2+和Mg2+的DPBS，因為二價陽離子對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能很重要。
Laminin 521 所需的工作濃度取決于細胞和應用。我們建議初始包被濃度為0.5μg/cm2。
表1. 不同培養(yǎng)容器的推薦重組人層粘連蛋白工作液的加入量
培養(yǎng)皿 | 包被濃度（μg/mL） | LN521加入量 | 1*DPBS加入量 | 總體積 |
6孔 | 5 | 50 μL/孔 | 950 μL/孔 | 1 mL/孔 |
12孔 | 5 | 25 μL/孔 | 475 μL/孔 | 0.5 mL/孔 |
24孔 | 5 | 15 μL/孔 | 285 μL/孔 | 0.3 mL/孔 |
48 孔 | 5 | 7.5 μL/孔 | 142.5 μL/孔 | 150 μL/孔 |
96孔 | 5 | 3.5 μL/孔 | 66.5 μL/孔 | 70 μL/孔 |
35mm培養(yǎng)皿 | 5 | 50 μL/孔 | 950 μL/孔 | 1 mL/孔 |
60mm培養(yǎng)皿 | 5 | 100 μL/孔 | 1900 μL/孔 | 2 mL/孔 |
100mm培養(yǎng)皿 | 5 | 300 μL/孔 | 5700 μL/孔 | 6 mL/孔 |
*以上體積以5μg/mL包被濃度為例
將體積的層粘連蛋白-DPBS混合物加入每個孔中，輕輕搖晃。確保整個表面都被層粘連蛋白包被溶液覆蓋，為未涂層的表面不支持細胞生長。
將板子放入37°C培養(yǎng)箱中孵育過夜，最短孵育時間為2小時，但建議過夜培養(yǎng)以獲得理想的細胞培養(yǎng)條件。注意不要讓培養(yǎng)容器干燥，會使LN521失活。
當細胞準備好接種時，吸出層粘連蛋白521溶液。
iPSC 培養(yǎng)
ipsc解凍（以12孔板為例）
1.1 將 iPSC 從液氮或干冰中取出 ，在 37°C水中解凍10 秒。
1.2 用75％酒精對冷凍管進行消毒，并將其轉(zhuǎn)移到工作臺面上。
1.3 將細胞轉(zhuǎn)移到一個新15 mL離心管中，離心管中含有9 mL DMEM?F12。
1.4 將15 mL離心管在室溫下以300g離心5min。
1.5 將已包被好的12孔板中的層粘連蛋白溶液棄去。
1.6 棄去細胞上清液，用1 mL mTeSR-plus（含10 µM Y-27632 ）輕輕重懸 iPSC，然后將其轉(zhuǎn)移到已包被好的12孔板中。搖動板以均勻分布細胞，最終細胞密度為1×10^5細胞/孔，靜置，室溫下放置10分鐘。確保培養(yǎng)在4~5天內(nèi)傳代。
表2.不同培養(yǎng)容器的細胞接種密度，根據(jù)細胞的生長速度確定細胞數(shù)量
細胞培養(yǎng)容器 | 6孔 | 12孔 | 24孔 | 96孔 |
細胞數(shù)量 | 2.5~3.5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0.5~1×104 |
1.7 將12孔板放回37°C培養(yǎng)箱孵育。
1.8 含ROCK抑制劑的培養(yǎng)基應在12~16小時后除去，繼續(xù)在不含抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
ipsc傳代方案
2.1 棄去培養(yǎng)上清，用1 mL PBS(Ca??/Mg??)沖洗。
注意：使用不含Ca2+ 和 Mg2+的PBS，因為二價陽離子對某些解離酶有負面影響。
2.2 棄去PBS，加入0.5 mL Gentle Cell Dissociation Reagent。室溫下放置6-8分鐘或放在顯微鏡下觀察，直至細胞不再結(jié)合到板上。
2.3 加入等體積的DMEM-F12，輕輕混勻細胞，在室溫轉(zhuǎn)移到離心管中，以300g離心5min。
2.4 在傳代細胞前，準備一個層粘連蛋白包被的12孔板。
2.5 棄去上清液并用含有 10 µM Y?27632 的 mTeSR?plus 培養(yǎng)基重新懸浮細胞。
2.6 將細胞轉(zhuǎn)移到準備好的層粘連蛋白包被的12孔板中。輕輕搖動板以均勻分布細胞，并室溫下放置10至20分鐘。
2.7將12孔板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育。
注意：ipsc長成單層后會迅速分化并死亡。為了保持生長和多能性，需在其長滿前進行傳代。
ipsc的冷凍保存
3.1 準備好溫和細胞解離試劑。
3.2 按照ipsc傳代方案進行細胞分離，使用細胞器計數(shù)，確保冷凍保存前的細胞密度。
3.3 每管細胞應以1-2×10^6細胞密度凍存。按照ipsc傳代方案中，離心、取出細胞培養(yǎng)基的步驟進行。將分離的iPSC沉淀重懸于適當體積的冷凍保存液中。
3.4 將1 mL 重懸的細胞冷沉淀加入1.5mL凍存管中，進行程序降溫，然后轉(zhuǎn)移到到液氮中，長期儲存。
層粘連蛋白包被的重要注意事項
1.實驗方案中的所有步驟均須在無菌條件下執(zhí)行。
2.避免層粘連蛋白長時間暴露在室溫下。
3.應避免反復凍融
4.解凍后，未稀釋的蛋白原液在無菌條件下儲存于 2~8℃保存，可穩(wěn)定保存至少3 個月。
相關(guān)產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Recombinant Human Laminin 521 Protein（Animal-Free） 重組人層粘連蛋白521蛋白(無動物源） | 92602ES | 10μg/100μg/500μg/1mg |
Y?27632 | 53006ES | 1mg/5mg/10mg/50mg |
