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酶標(biāo)儀用于檢測鈣離子通路的兩種方式
閱讀：2959發(fā)布時(shí)間：2020-2-26
酶標(biāo)儀用于檢測鈣離子通路主要通過兩種方式：
1，熒光法?；衔锱c細(xì)胞膜上離子通道結(jié)合后，改變離子通道狀態(tài)，通道打開，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光指示劑結(jié)合，發(fā)出熒光后酶標(biāo)儀捕獲，熒光強(qiáng)度與進(jìn)入細(xì)胞的鈣離子含量成正比。熒光指示劑多用FLuo3，F(xiàn)luo3-AM是一種可以乙酰甲酯衍生物，可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切成FLuo3并滯留在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞后與之結(jié)合，會發(fā)出較強(qiáng)的熒光。
2，發(fā)光法。水母發(fā)光蛋白復(fù)合物（Aequorin）由22kDa的水母蛋白（Apoaequorin protein）、分子氧和底物腔腸素組成。只有當(dāng)鈣離子（Ca2+）與該復(fù)合物結(jié)合后，腔腸素才能被氧化生成高能量產(chǎn)物Coelenteramide，同時(shí)釋放出CO2和藍(lán)色熒光（——466 nm）。正是此Ca2+依賴性的反應(yīng)過程（見圖1），使得腔腸素非常適用于監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平。與常規(guī)的熒光鈣離子指示劑相比，其主要具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，1）能檢測較大范圍的鈣濃度 – 從0.1 μM至 >100μM；2）樣品無自體熒光，背景熒光低于使用熒光鈣離子指示劑；雖然信號比使用熒光鈣離子指示劑弱，但是通過成像儀器可以得到更高的信噪比，因此具有更高的靈敏度。3）水母發(fā)光蛋白復(fù)合體能夠穩(wěn)定維持在細(xì)胞內(nèi)，使其能夠進(jìn)行數(shù)小時(shí)至數(shù)天的鈣離子監(jiān)測。
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