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上海寶葉生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·5年您現(xiàn)在的位置： 首頁(yè)> 公司動(dòng)態(tài)> 平衡法選擇高親和力噬菌體抗體
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1．多樣化的噬菌體抗體丈庫(kù)中制備噬菌體抗體。
2．根據(jù)廠家說(shuō)明，對(duì)抗原進(jìn)行生物素化。
3．選擇前，在1個(gè)1．5m1微量離心管中．用2％MPBS 1m1封閉150ul鏈霉親和素磁珠，室溫1小時(shí)。用磁性試管架將碰珠吸向一側(cè)。棄去緩沖液。
4．用2％MPBS封閉3個(gè)1．5m1微量離心管，室溫1小時(shí)；而后，棄去封閉緩沖液。以3個(gè)不同濃度將士物素化抗原（總共3管）與溶于2％MPDS（終濃度）的1m1噬茼體樣品（大約1012c{u／m1）進(jìn)行孵育，室溫振蕩l小時(shí)。對(duì)于*輪選擇，抗原濃度應(yīng)分別為Kd／l、Kd／10以及Kd／100；此處Kd＝針對(duì)抗原的野生型抗體親和力。
5．每管加入50u1鏈霉親和素化磁珠并在轉(zhuǎn)臺(tái)上孵育，室溫15分鐘。將試管放入磁架30秒。磁珠將移向磁體。
6．抽吸上清，讓磁珠留在微量離心管一側(cè)。是用200u1吸頭套在巴氏吸管上，再接 到真空源上進(jìn)行。用PBS／Tween洗滌磁珠7次（每次洗滌用lml），接著用MPBS洗滌2次，再用PBS洗滌1次。每隔一次洗滌就將磁珠轉(zhuǎn)移到1個(gè)新的1．5m1試管中，以充分洗滌。
7．用100u1 100mmol／L HCl將噬菌體從磁珠上洗脫下來(lái)，室溫10分鐘。將試管放入磁架30秒，沉淀磁珠。移取含有洗脫的噬茼體上清，并用1m11inol／L Trls（pH 7．4） 中和。冰上保存洗脫液。
8．將0．75m1洗脫噬菌體加入到10ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的大腸桿菌TGl（A600約0．5） 中。4℃下儲(chǔ)存剩余的洗脫噬菌體。
9．37℃下靜置孵育洗脫物—大腸桿菌混合液，30分鐘。
10．將1ul和10ul感染的TGl細(xì)胞在100mmTYE／amp／glu平板上鋪板接種，滴定洗脫液（稀釋比例分別為104和103）。
11．離心剩余的細(xì)菌培養(yǎng)液，2700g 10分鐘。將沉淀重懸于250ul 2×TY中，并在2個(gè)150mmTYE／amp／R1u平板上鋪板，37℃孵育過(guò)夜。
12．次晨，每個(gè)平板加入3m1 2×TY／amp／glu，再用彎曲玻璃棒自平板上刮取細(xì)菌。將1．4ml菌液與0．6m1 50％的甘油（無(wú)菌過(guò)濾）混合制備甘油儲(chǔ)存料。-70℃下保存。分析產(chǎn)出滴定結(jié)果（步驟9）以確定哪個(gè)（從抗原農(nóng)度＝Kd／1、Kd／l0以及Kd／100）確定出相應(yīng)的噬菌體以用于下一輪選擇的改良。過(guò)去，我們依據(jù)噬菌體EUSA測(cè)定的結(jié)合性克隆陽(yáng)性率或依據(jù)BIAcore測(cè)定的活性噬菌體濃度，進(jìn)行判斷。不過(guò)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，可以通過(guò)分析產(chǎn)出滴度作出選擇： 當(dāng)產(chǎn)出滴度比抗原濃度下降更明顯時(shí)（即當(dāng)比較來(lái)自Kd／l、Kd／10以及Kd／100的3個(gè)產(chǎn)出滴度時(shí)），一般是結(jié)合減少的結(jié)果，那么此濃度下的噬茵體不應(yīng)用于后續(xù)的選擇。而應(yīng)當(dāng)用較高抗原濃度的噬菌體替代。我們每輪把抗原濃度平均降低大約90％倍，而在親和力成熟的zui后一輪常常使用飛摩爾的的抗原濃度。
13．從來(lái)自步驟ll的合適的甘油儲(chǔ)存料中制備噬菌體抗體；從本實(shí)驗(yàn)方案步驟1重復(fù)進(jìn)行。
