徠卡顯微鏡觀察斑馬魚活體細(xì)胞
在特殊照明、電腦程序和樣品制備的幫助下，徠卡顯微鏡觀察細(xì)胞特別是活體內(nèi)細(xì)胞，能得到細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞動力學(xué)的寶貴信息。不過，這對于高等生物尤其困難。德國卡爾斯魯厄理工學(xué)院（KIT）、馬克斯·普朗克協(xié)會高分子研究所,以及美國國家衛(wèi)生研究所（NIH）的研究人員，通過一種新觀察方法觀察到八分之一微米大小的幼魚細(xì)胞結(jié)構(gòu)。該研究發(fā)表在NatureMethods雜志上。
“斑馬魚的幼魚是*透明的，特別適合徠卡顯微鏡細(xì)胞遺傳學(xué)研究，”KIT的MarinaMione解釋道。為了觀察其特定結(jié)構(gòu)，研究人員通常通過用徠卡顯微鏡觀察的基因工程方法徠卡顯微鏡對幼魚進(jìn)行熒光染料染色。Mione研究了斑馬魚細(xì)胞骨架的一部分，微管。這些線狀微管長約100µm直徑約20nm，相當(dāng)于人類頭發(fā)的十萬分之一。“細(xì)胞中微管無處不在，并且細(xì)胞需要通過微管進(jìn)行分裂和運(yùn)動。”
在這項新的徠卡顯微鏡觀察方法中，徠卡顯微鏡樣品不是*被照明，而是特定點由特殊光照明。散射光被降至zui低，樣品細(xì)節(jié)非常清晰。隨后，電腦控制拍攝多種照明的一系列照片，從而得到一個總體圖片。這種巧妙的照明方式甚至允許調(diào)節(jié)景深，電腦控制能對多種景深進(jìn)行拍照，然后將其結(jié)合為三維圖像。“同時，這種徠卡共聚焦顯微鏡觀察技術(shù)平面分辨率能達(dá)到145nm而軸向分辨率能達(dá)到400nm，”MarinaMione說。該技術(shù)能在幾秒內(nèi)完成拍照，這樣細(xì)胞活動就不會引起清晰度下降。
研究人員基于一系列的徠卡共聚焦顯微鏡所拍的圖片圖片，得到了微管運(yùn)動的動態(tài)視頻。在該實驗中，對斑馬魚皮下約45µm的側(cè)線發(fā)育情況進(jìn)行了超過60分鐘的觀察。斑馬魚通過側(cè)線感知水流刺激。這種生活器官的圖像也為研究脊椎動物細(xì)胞水平發(fā)育提供了寶貴信息。生活在淡水中的熱帶斑馬魚，作為一種遺傳學(xué)模型生物有許多優(yōu)勢。其大小易于培養(yǎng)，同時也足夠研究人員分辨單獨(dú)的器官。在徠卡顯微鏡的觀察下，斑馬魚的繁殖周期短，能產(chǎn)生大量后代。做為一種脊椎動物，它也具有一些和人類相同的生物學(xué)特性。
研究人員使用結(jié)構(gòu)照明
徠卡共聚焦顯微鏡技術(shù)（SIM），得到了活體多細(xì)胞生物的超分辨率3D圖像。DMD產(chǎn)生的多交點照明模式使研究者能排除焦外光干擾，從而使3D成像的樣品厚度比普通SIM成像厚八倍。研究人員用徠卡每秒拍攝一次2D圖像，分辨率低至水平145nm軸向400nm。研究人員在活體轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎超過45μm深處，得到了GFP標(biāo)記的微管圖像。拍攝到了斑馬魚側(cè)線的動力學(xué)變化，并觀察到了包裹在膠原內(nèi)的細(xì)胞中myosinIIA與F-actin相互作用。
