動(dòng)物外周血 NK 細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法

【產(chǎn)品規(guī)格】

 2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶(hù)使用，試劑內(nèi)容如下：

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

 A． 適用儀器：zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

 B． 耗材：

全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。

首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例加樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119）混勻，根據(jù)

稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：

情況 A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

  1.取一支 15ml 離心管，依次小心加入試劑 B 3ml、試劑 D 2ml，制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。（稀釋后的血液樣本量小于 3ml 時(shí)，試劑 B 和試劑 D 用量分別為 2ml 和1ml。）

  2.用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。

  3.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為五層。*層為血漿層。第二層為試劑 D 層。第三層為環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層。第四層為試劑 B 層。第五層為紅細(xì)胞層。

  4.用吸管小心吸取第二層試劑 D 層和第三層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。

  5.250g，離心 10min。

  6.棄上清。

  7.用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

  8.250g，離心 10min。

  9.重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

  10.差異貼壁法純化細(xì)胞

（1）用 NK 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：CNK2015）或 NK 細(xì)胞*培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)：HCNK2015）以 1.5-3×10⁶ 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

（2）2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱(chēng)為單核細(xì)胞）。

（3）10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。

注：

  a.無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清。

  b.*培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。

  c.由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開(kāi)已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰性分選。

情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

  1.取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，依次小心加入試劑 B、試劑 D（體積比為 5:3，試劑總量與稀釋后的樣本量相等），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

  2.將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，450-650g（zui大離心力可至 1000g），離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到*分離效果。加入血液樣本后，樣本及分離液總體積不得超過(guò)離心管總體積的三分之二）。

  3. 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 10。

【注意事項(xiàng)】

  1.全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

  2.本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

  3.吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

  4.吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

  5.如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)?zhí)旖驗(yàn)笠詫で髱椭?，具體詳見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟

封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn) NK 細(xì)胞提取率大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶(hù)可適當(dāng)進(jìn)行參考。

A.流式細(xì)胞技術(shù)

B.免疫組化技術(shù)

C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問(wèn)題及解決方法】

  1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

  2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶(hù)可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

  3.本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效果，

離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。