植物激素ELISA測定方法說明

植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶聯(lián)吸附免疫分析（ELISA），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一種類型。在ELISA中，抗原抗體反應(yīng)的檢測依靠酶標(biāo)記物來實(shí)現(xiàn)，常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標(biāo)記激素分子，稱為酶標(biāo)植物激素，也可標(biāo)記于第二抗體（識別抗激素抗體Fc片段的抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白），稱為酶標(biāo)二抗。這兩類標(biāo)記物分別用于固相抗體型和固相抗原型ELISA。A.固相抗體型ELISA：將抗激素的單克隆抗體（Mab）與已吸附于固相載體上的兔抗鼠Ig抗體（RAMIG）結(jié)合，然后加入激素標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，使其與固相化的Mab結(jié)合， 再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記激素（酶標(biāo)激素）。通過測定酶標(biāo)激素的被結(jié)合量，可換算出未知樣品中激素的數(shù)量。B.固相抗原型ELISA：將“激素-蛋白”復(fù)合物（該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白）包被于固相載體，加入待測激素（樣品或標(biāo)準(zhǔn)品）和抗IAA多克隆抗體（Pab）反應(yīng)，進(jìn)行競爭反應(yīng)。然后讓HRP標(biāo)記羊抗兔Ig抗體（HRP-GARIG）與結(jié)合在固相上的Pab反應(yīng)，通過測定與固相結(jié)合的酶量，換算出未知樣品中激素的含量。 

二、材料、 儀器 設(shè)備及試劑 

（一）材料：高等植物、真菌、藻類等組織或器官。 

（二） 儀器 設(shè)備：1. 酶聯(lián)免疫檢測儀；2. 高速冷凍離心機(jī)；3. 恒溫箱；4. 連續(xù)進(jìn)樣器；5. 渦旋儀；6. 96孔微孔板；7. 離心管；8. 研缽或勻漿器；9. 試管。 

（三） 試劑 1. 洗滌緩沖液：0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液（PBS），含0.05％Tween-0；2. RAMIG溶液，或“激素-蛋白”復(fù)合物；3. 0.1％封閉蛋白（該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白）；4. 抗激素Mab，或Pab；5. 激素標(biāo)準(zhǔn)品母液，及參比系列溶液（按雙倍或四倍系列稀釋）；6. HRP標(biāo)記激素，或HRP-GARIG；7. 鄰苯二胺（OPD）基質(zhì)液：5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS，用前加入30％H ₂ O ₂ 12.5μl。 

三、實(shí)驗(yàn)步驟 

固相抗體型ELISA。 
1. 用方陣法滴定選擇各反應(yīng)物zui適工作濃度； 
2. 將100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔，4℃濕盒，12h； 
3. 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干； 
4. 加入100μl抗激素Mab溶液，37℃70min；

四、計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD  值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的

OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計算出標(biāo) 準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，

即為樣品的實(shí)際濃度。 注意事項(xiàng)

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未 用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時間 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值 大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計 算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。