地高辛 DIG 應(yīng)用小帖士

DNA 的標(biāo)記和檢測（Southern Blotting）
     如果用以探針合成的DNA 的模板的數(shù)量比較少或是質(zhì)量不夠高的時候，建議您使用PCR DIG Probe Synthe
sis Kit。該試劑盒是于制備高靈敏度的雜交探針，例如單拷貝的基因。其另一個特點就是無需定量斑點檢測
過程，通過定量凝膠電泳就可以快速確定PCR 標(biāo)記探針的效率。
     如果您手上有足夠量的高純度模板，建議您選用隨機(jī)引物標(biāo)記方法的DIG High Prime DNA Labeling and D
etection Starter Kits I 和II。這兩個試劑盒包含了標(biāo)記，封閉，雜交和檢測所需要的所有試劑，是真正意義上的
一站式服務(wù)的試劑盒，提供您DIG 標(biāo)記和檢測實驗需要的所有產(chǎn)品。它們之間的差別在于檢測方法的不同：Sta
rter Kits I 采用了顯色法，使用LE NBT/BCIP；而Starter Kits II 選用化學(xué)發(fā)光法底物CSPD。
RNA 的標(biāo)記和檢測（Northern Blotting）
     在Northern blotting 中即可以使用DNA 探針，也可以使用RNA 探針。通常，RNA 探針的特異性和靈敏度度
都會更高一些；當(dāng)然如果對靈敏度和特異性沒有特別嚴(yán)格的要求的話，DNA 探針會更方便操作。
     如果您需要制備RNA 探針的話，推薦您使用Northern Starter Kit。該試劑盒以線性的DNA 為模板，通過SP
6, T7 或是T3 RNA 聚合酶的作用將DIG-11-UTP 摻入到轉(zhuǎn)錄的RNA 中，借助化學(xué)發(fā)光底物CDP-Star 檢測。另
一個產(chǎn)品DIG RNA Labeling Kit 也可用于RNA 探針的標(biāo)記。
標(biāo)記探針的定量
      盡管DIG 系統(tǒng)的靈敏度很高，為了獲得理想的實驗結(jié)果，標(biāo)記探針和模板的用量是很重要的。同樣在每次標(biāo)
記實驗后，通過spot test 檢測探針的標(biāo)記效率也是非常重要的，可用以準(zhǔn)確計算雜交實驗中的探針用量。雜交實
驗中探針用量的不準(zhǔn)帶來的影響是顯而易見的：探針的用量太多會帶來太多的背景問題，而探針的用量過少，則
又會導(dǎo)致雜交信號太弱。DIG 系統(tǒng)的優(yōu)勢就在于：DIG PCR 探針的產(chǎn)量可以通過凝膠電泳的方式來定量。RNA
探針則可以檢測到探針的完整性。
雜交溫度
      雜交條件的優(yōu)化取決于雜交片段的類型以及GC 含量。RNA-RNA 和RNA-DNA 間的雜交溫度就要比DNADNA
間的高?？傮w來說，不同片段間的雜交作用力RNA-RNA>RNA-DNA>DNA-DNA。因此做為一個通常的規(guī)
律，以40％GC 含量的哺乳動物目的片段為例，在DIG Easy Hyb (DIG 系統(tǒng)，無毒，不含DNase、RN
ase 和任何的污染物) 或是50％甲酰胺存在環(huán)境下的雜交溫度分別是：

DNA-DNA: 37-42℃
DNA-RNA: 50℃
RNA-RNA: 68℃

靶核酸的膠上樣量
      由于DIG 系統(tǒng)的高靈敏度的特點，靶核酸的膠上樣量要小于其他的系統(tǒng)（Table 2）。同時DIG 系統(tǒng)匹配的
陽離子的尼龍膜也為DIG 標(biāo)記的雜交檢測實驗提供了zui強(qiáng)的信號和zui低的背景影響。
檢測方法
       對于探針和靶序列間形成的雜交子的檢測通常使用堿性磷酸酶耦聯(lián)的抗體，采用顯色或化學(xué)發(fā)光法檢測（ta
ble 3）。在眾多的堿性磷酸酶的底物中，我們推薦使用CDP-Star 或CSPD 用于化學(xué)發(fā)光檢測，NBT/BCIP 用于
顯色反應(yīng)。此外對于膜雜交中的化學(xué)發(fā)光信號的檢測，建議使用Lumi-Film 以獲得的信號。
探針的撥離和重探
      每一個探針的雜交信號都很強(qiáng)，基本上沒有什么背景信號。在探針的撥離過程中沒有明顯的靶RNA 的丟失。使
用探針撥離和重探技術(shù)，單一的一樣張膜上可進(jìn)行多達(dá)14 次的檢測分析。

檢測底物
   即用型CDP-Star
      堿性磷酸酶作用于CDP-Star 底物，產(chǎn)生的光信號被X 膠片曝光或是圖像設(shè)備采集。與CSPD
相比較，CDP-Star 的主要特點在于由于光信號產(chǎn)生的速度更快（10 倍于CSPD）同時強(qiáng)度更強(qiáng)，可大量縮短曝
光時間。其信號的釋放可以持續(xù)大概兩天的時間，因此可以進(jìn)行多次曝光?；瘜W(xué)發(fā)光的底物僅僅適用于尼龍膜。
   即用型CSPD
      堿性磷酸酶作用于CSPD 底物，產(chǎn)生的光信號可被X 膠片（例如：Lumi-Film）或是圖像設(shè)備采集。由于其同樣
具有持續(xù)的發(fā)光過程，因此也可以進(jìn)行多次曝光。在尼龍膜上使用CSPD 或CDP-Star 底物的雜交，還可進(jìn)行探
針的撥離和重探。
  NBT/BCIP
      使用類似NBT/BCIP 顯色底物的好處就在于，檢測的過程中不在需要X 膠片，既可以使用尼龍膜也可以是使用
硝化纖維素膜。然而，如果想要獲得高靈敏度的檢測結(jié)果，可能就需要較長的時間了（幾個小時）。這種方法也
有其不足之處：首先通過這種方法只能一次性獲得信號，不能多次檢測；在探針撥離前，需要使用二甲基甲酰胺
先將膜上沉淀的顏色去除。
   其他的底物和抗體
      在整個DIG 系統(tǒng)中，還有其他的一些底物和多種熒光抗體，例如Fast Red Tablets, BM Purple, HNPP
Fluorescent Detection Set)和DAB POD Substrate；供不同研究的需要。