徠卡倒置熒光顯微鏡電鏡標(biāo)本制備方法

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徠卡倒置熒光顯微鏡的掃描電鏡觀察的表面一般是組織或器官的自然表面，如呼吸邏，消化道，泌尿及生殖管道的上皮表面。機(jī)體中分散細(xì)胞的自然表面以及骨胳等硬組織的自然面等。取材時(shí)，對于待觀察的部分要保護(hù)好，切勿用器械觸碰。如果上面粘有分泌物，粘濃或糞塊等污物，必須在固定前去除，以免遮蓋表面微紉結(jié)構(gòu)，清除的方法一般是用溫生理鹽水或緩沖液沖洗或噴射沖洗，硬組織可用超聲波（低頻）清洗。有的實(shí)驗(yàn)室用蛋白酶類清洗表面的粘液，但必須注意，蛋白酶不僅可除去表面粘附物，也可破壞樣品表面的蛋白質(zhì)。對于分散細(xì)胞表面的處理參見另一節(jié)。需特別提出的是，暴露出的表面需要清洗，但保存標(biāo)本的原則與透射電鏡標(biāo)本*相同；如動(dòng)物處死方法，取材速度及要求樣品中斷血液供應(yīng)后1—2分鐘內(nèi)進(jìn)入團(tuán)定液等。與透射電鏡標(biāo)本*不同的一點(diǎn)是樣品體積可大些。由子樣品臺(tái)較大，景深較深，掃描電鏡樣品塊可在10mm見方，5mm高的范圍。

為確定徠卡顯微鏡分辨率，可使用半半徑（halfmdius縮寫HR）或半距離〔hdfdLshnce縮寫HD）這兩個(gè)參數(shù)。HR是這樣一個(gè)距離，對于一個(gè)點(diǎn)狀放射源，它所產(chǎn)生的全部顯影顆粒中的一半將落在以放射源為圓心，以HR為半徑的一個(gè)圓內(nèi)；對于一個(gè)線狀放射源，它所產(chǎn)生的全部顯影顆粒中的一半將落在放射源兩側(cè)寬度各為HD的一個(gè)帶內(nèi)。HR與M對于電鏡放射自顯影的定量分析是兩個(gè)十分重要的基本參數(shù)。

電鍍標(biāo)本必須干燥。我們觀察用徠卡顯微鏡樣品是觀察細(xì)胞表面的原貌，富有微細(xì)結(jié)構(gòu)的樣品表面往往經(jīng)過脫水及干燥后（特別是空氣中干燥后）發(fā)生嚴(yán)重變形。原因是液價(jià)（特別是水）的表面張力破壞了微紉結(jié)構(gòu)。雖然有些可揮發(fā)介質(zhì)如乙醇或丙圍的表面張力較小，但對類如氣管上皮表面纖毛這樣的細(xì)微結(jié)構(gòu)仍有損傷。因此，自掃描電鏡問世后，雖然不少學(xué)者擬用于觀察生物樣品，就是因?yàn)檫^不好“干燥”這一關(guān)而未曾得到好的生物軟組織的徠卡倒置熒光顯微鏡掃描電鍍照片。自從1969年開始使用臨界點(diǎn)用于操作后，將掃描電鏡的生物樣品制備大大推進(jìn)了一步。目前世界上電鏡實(shí)驗(yàn)室多應(yīng)用臨界點(diǎn)干燥法與冷凍干燥法對掃描電鏡進(jìn)行干燥。