一、目的要求

通過(guò)實(shí)驗(yàn)掌握植物組織培養(yǎng)中的無(wú)菌操作技術(shù)。學(xué)習(xí)培養(yǎng)基的配制及滅菌，掌握植物外植體表面消毒的常規(guī)方法。

二、基本原理

近年來(lái)，植物組織培養(yǎng)作為一種研究技術(shù)已被廣泛。植物組織培養(yǎng)是應(yīng)用無(wú)菌操作方法培養(yǎng)植物器官或組織地任何一部分，甚至單個(gè)細(xì)胞的觀察。植物組織培養(yǎng)中的無(wú)菌技術(shù)主要包括培養(yǎng)基的配制與滅菌。

1．MS 培養(yǎng)基的配制：

對(duì)植物外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分等。不同材料對(duì)培養(yǎng)基的要求不同，適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)和選用培養(yǎng)基，對(duì)植物組織培養(yǎng)取得成功是至關(guān)重要的。另外，對(duì)組織培養(yǎng)物的脫分化和再分化等狀態(tài)的調(diào)控、次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等都是通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分來(lái)實(shí)現(xiàn)。培養(yǎng)基的主要成分包括無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、碳源、維生素、植物生長(zhǎng)物質(zhì)和有機(jī)附加物等。植物生長(zhǎng)物質(zhì)是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用。配制培養(yǎng)基通常都按配方濃度的若干倍稱量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用時(shí)按比例稀釋。一般要配下列母液：大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽母液、植物生長(zhǎng)物質(zhì)母液、有機(jī)化合物母液。

2．培養(yǎng)基滅菌：

凡是暴露在（未經(jīng)處理的）空氣中的物體，曾經(jīng)接觸過(guò)自然水源的物體都是有菌的。培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有植物細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是各種細(xì)菌、真菌滋生繁殖的*場(chǎng)所。組織培養(yǎng)必須采用無(wú)菌技術(shù)，在取材、接種、培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程中，必須嚴(yán)格進(jìn)行培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的滅菌，同時(shí)，嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作，防止污染。

3．植物外植體消毒和接種：

用于進(jìn)行組織培養(yǎng)的組織、器官和細(xì)胞稱為外植體。在組織培養(yǎng)中，外植體如果是帶菌的，在接種前都必須進(jìn)行表面消毒，這是取得培養(yǎng)成功的zui基本的和重要的前提。常用消毒劑對(duì)外植體進(jìn)行消毒。從室外取的材料，一般先用自來(lái)水沖洗數(shù)分鐘，對(duì)表面不光滑或長(zhǎng)有絨毛等結(jié)構(gòu)不容易洗凈的材料，自來(lái)水沖洗的時(shí)間要長(zhǎng)，幾個(gè)小時(shí)或者24h，并且用洗衣粉或洗潔精洗滌，必要時(shí)用毛刷刷洗。洗后的材料用濾紙擦干，然后浸泡在消毒溶液中。接種材料使用消毒劑后，要用無(wú)菌水洗滌3～5 遍，zui后用無(wú)菌紙擦干凈。使用消毒劑的原則是既要達(dá)到消毒目的，又不能損傷植物組織和細(xì)胞，還要符合就地取材的原則。對(duì)一些容易污染、較難滅菌的外植體進(jìn)行表面消毒時(shí)，用單一消毒劑不能收到好的效果，所以常選用兩種消毒劑交替浸泡法。一般，首先用75％乙醇浸泡外植體數(shù)秒鐘至30s，然后置于0.1％HgCL溶液5～10min 或含有2％活性氧的次氯酸鈉溶液5～30min，然后用無(wú)菌水洗滌。有時(shí)在HgCL或次氯酸鈉滅菌后，用無(wú)菌水洗，進(jìn)一步剝?nèi)讓咏M織或器官如葉片后，再用次氯酸鈉滅菌3～5min，無(wú)菌水漂洗3 次后，切割、用于接種。

用消毒劑對(duì)接種材料進(jìn)行滅菌處理時(shí)，可以在滅菌溶液中加入1～2 滴表面活性劑，如吐溫80或吐溫20，它們可以濕潤(rùn)外植體整個(gè)組織，促進(jìn)滅菌液充分接觸表面組織，達(dá)到較好的消毒效果。有時(shí)還可以用磁力攪拌、超聲振動(dòng)等方法使消毒殺菌劑進(jìn)入外植體。消毒溶液對(duì)外植體消毒是在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。完成表面消毒的接種材料要盡快放置于培養(yǎng)基中。

三、器材

1．試劑：硝酸胺，硝酸鉀，磷酸二氫鈉，硫酸鎂，氯化鈣，硫酸鐵，乙二胺四乙酸，2，4 -D ,BA lmol/L 鹽酸，lmol/L 氫氧化鈉、0.1％HgCL（劇毒!）, 75％乙醇無(wú)菌水，無(wú)菌培養(yǎng)皿，MS 培養(yǎng)基。

2 ．器具：電子天平，冰箱，pH 試紙，燒杯，量筒，試劑瓶，三角瓶，吸耳球，刻度吸管，洗瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、各種接種工具、無(wú)菌紙、一次性手套、酒精燈、標(biāo)簽紙、記號(hào)筆、鑷子、剪刀、解剖刀。

3 . 材料:胡蘿卜塊根、綠豆種子、非洲澎蜞菊葉片。

四、操作步驟

（一）培養(yǎng)基配制的一般操作程序是（圖1－1,表1－1）：

1 ．大量元素母液的配制：

2 ．鐵鹽母液配制：按MS 培養(yǎng)基配方所列FeSO4·7H2O 和EDTA－Na2·2H2O 含量擴(kuò)大100 倍進(jìn)行實(shí)際稱量，依大量元素母液的步驟，配制母液300mL ，貼上標(biāo)簽，10℃保存。

3 ．植物生長(zhǎng)物質(zhì)母液配制：本實(shí)驗(yàn)分別配制500mg/L 2,4-D 和300mg/L 6-BA 母液。

（二）植物外植體消毒和接種：

1 ．接種前，用75 ％乙醇棉球或用2％苯扎溴銨溶液擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面，將培養(yǎng)基及用具放入工作臺(tái)，開(kāi)超凈工作臺(tái)紫外燈照射至少20 min，然后開(kāi)送風(fēng)開(kāi)關(guān)，之后關(guān)閉紫外燈，通風(fēng)10 min后，再開(kāi)日光燈進(jìn)行無(wú)菌操作。

2 ．將胡蘿卜塊根在自來(lái)水下沖洗干凈，用小刀切去外圍組織，切成小塊分別放100 mL 燒杯中，用75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%HgCL溶液分別浸泡2 、5 、10 min ，用無(wú)菌水洗滌3 次，無(wú)菌紙吸干水分。取出培養(yǎng)皿，剪刀和鑷子使用前插入90％乙醇溶液中，使用鑷子時(shí)在酒精燈火焰上熾燒片刻，冷卻后，切取髓部組織0.5cm 。以上操作都要在試管口靠近火焰旁。

3 ．將培養(yǎng)容器斜面向上，并使它們拉于水平位置，也可將培養(yǎng)容器放在左手中。將塞蓋用右手?jǐn)Q轉(zhuǎn)松動(dòng)，以便接種時(shí)拔出。用火焰灼燒管口，灼燒時(shí)應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動(dòng)試管口（靠手腕的動(dòng)作，使試管口沾染的少量菌得以燒死）。將燒過(guò)的接種針（環(huán)）觸動(dòng)培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的外植體，然后輕輕接觸外植體，慢慢將接種針（環(huán)）抽出試管，打開(kāi)培養(yǎng)容器蓋，將外植體放在培養(yǎng)基上，每瓶放3 塊。封口，貼標(biāo)簽，注明姓名，標(biāo)明時(shí)間和材料名稱。整理好接種室（箱）的臺(tái)面，搞好清潔衛(wèi)生。

4 ．用水洗干凈非洲澎蜞菊葉片，用濾紙擦干后置于100 mL 燒杯中，在超凈工作臺(tái)上加入75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1％HgCL溶液浸泡3 、5 、7 min，用無(wú)菌水洗滌3 次，將葉片切成長(zhǎng)1cm ,按照上述同樣的步驟接種于培養(yǎng)基上。

5 ．綠豆種子用75％乙醇溶液浸泡30 s，然后用0.1％HgCL溶液（加入吐溫2 滴）浸泡3 、5 、10 min ，期間不斷攪拌溶液，用無(wú)菌水洗滌5～6 遍，洗干種子外圍水分，按照上述同樣的步驟接種于培養(yǎng)基上。

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1. 用表格表示高壓消毒滅菌的效果，如培養(yǎng)基、工具的消毒數(shù)目和消毒2 天后污染情況。

2. 觀察接種材料（葉片、種子或胡蘿卜肉質(zhì)根）接種后2～5 天的污染情況，用表格表示接種材料的數(shù)目、污染的外植體數(shù)，并計(jì)算污染率。污染率（% ) = （污染的材料數(shù)／總接種材料數(shù)×100%

如果培養(yǎng)材料大部分發(fā)生污染，說(shuō)明消毒劑浸泡的時(shí)間短；若接種材料雖然沒(méi)有污染，但材料已發(fā)黃，組織變軟，表明消毒時(shí)間可能過(guò)長(zhǎng)，組織被破壞死亡；接種材料若沒(méi)有出現(xiàn)污染，生長(zhǎng)正常，即可以認(rèn)為消毒劑使用濃度的適宜消毒時(shí)間。