細胞生物學(xué)生物大實驗的時候有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的大實驗，在這里詳細介紹了細胞培養(yǎng)中各種器皿的清晰和滅菌、培養(yǎng)基的配制、hanks液/d-hanks液等試劑的配制、細胞的傳代培養(yǎng)及其凍存與復(fù)蘇方法與操作步驟。

細胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動物體內(nèi)的組織(或器官)取出，模擬動物體內(nèi)的生理條件，在體外進行培養(yǎng).使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細胞的生長、繁殖、細胞分化以及細胞衰老等過程的生命現(xiàn)象。

細胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對細胞生長發(fā)育和分化等的影響;二是細胞培養(yǎng)便于人們對細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(如細胞骨架等)、細胞生長及發(fā)育等過程的觀察。因而細胞培養(yǎng)是探索和指示細胞生命活動規(guī)律的—種簡便易行的實驗技術(shù)，同時我們也不可忽略的另一個因素，那就是它脫離樂生物機體后的—些變化。

細胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等

這次的動物細胞培養(yǎng)是一個精細的，需要有步驟、有計劃的進行的實驗。主要步驟有：1、清洗與滅菌;2、培養(yǎng)基配制;3、Hanks、D-hanks液和消化液的配制、4、細胞傳代培養(yǎng);5、細胞的凍存與復(fù)蘇。可分幾次小實驗進行操作。

Ⅰ清洗與滅菌

一、實驗?zāi)康?/span>

能獨立地進行用于細胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。

二、實驗原理

清洗與消毒是組織培養(yǎng)實驗的*步，是組織培養(yǎng)中工作量zui大，也是zui基本的步驟。體外培養(yǎng)細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細胞養(yǎng)不好與清洗不*有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，哪怕殘留0.1個，也可能影響細胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價值、生物學(xué)特性或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。

三、實驗材料、用品

1、材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0.22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0.22 μm，過濾器(直徑25)。

2、藥品：70%或75%酒精，0.1%新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0.5%過氧乙酸，乳酸，37%甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業(yè))，DEPC水[體積分?jǐn)?shù)0.1%的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。

3、儀器：超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。

四、實驗步驟

(一)實驗器具清洗

l 玻璃類 1、主要有：培養(yǎng)瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，離心管，試管，培養(yǎng)皿等。

2、清洗步驟：

泡在含有洗潔凈的自來水中→撈出來用毛刷將實驗器具各個面刷洗至少25遍→自來水沖洗25遍→過一遍一蒸水→泡入鉻酸,(24h左右后)→從鉻酸中撈出器具，自來水沖洗25遍→過三遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱內(nèi)烘干→收入柜子備用→用前高溫滅菌(121℃，25min)→烘干→使用。

注意：新的玻璃器具先要泡鹽酸1天，然后清洗步驟與上面相同。

l 塑料類

1 塑料類器具主要包括：孔板，大槍頭，瓶蓋，濾器，采血管等。

2 清洗步驟：

(1)孔板，采血管

泡在有洗潔凈的自來水中→用超聲清洗儀超聲3遍(每遍1小時，200C)→在含有洗潔凈的自來水中用毛刷或者紗布將各個面刷洗至少25遍→過一遍一蒸水→泡入鹽酸過一個禮拜→從鹽酸中撈出后自來水沖洗25遍→過三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱內(nèi)烘干→收入柜子→用前包裝好照鈷→使用

(2)大槍頭，蓋子，濾器

在含有洗潔凈的自來水中用毛刷或者紗布將各個面刷洗至少25遍→用超聲清洗儀超聲1遍(每遍45分鐘，200C)→自來水沖洗→過三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱內(nèi)烘干→收入柜子→用前包裝好滅菌→使用

注意：(1)烘孔板時溫度不應(yīng)太高，烘干后用報紙包裹，裝入箱子內(nèi)，照鈷，便可使用。

(2) 新的培養(yǎng)瓶蓋子泡舊5%稀鹽酸1天→再用2%NaOH煮20min →自來水沖洗→洗潔精清洗→用超聲清洗儀超聲1遍(每遍45分鐘，200C)→沖洗15遍→過三遍一蒸(每遍3次)→過三遍三蒸水→烘干使用

(二)包裝與消毒

2、包裝

洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙(油光紙)等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。比如小青瓶，試管，移液管，血清瓶，培養(yǎng)瓶，離心管，孔板，槍頭，針式濾器等的包裝。其中針式濾器包裝之前要裝好濾膜，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中 。

2.1 包裝分類

局部包裝：較大瓶皿如細胞培養(yǎng)瓶，燒杯，容量瓶，三角瓶， 消毒筒以及體積較小，但瓶口包裝方便的容器如青霉素瓶等的包裝，通常采用局部包裝。

全包裝：體積較小的培養(yǎng)瓶皿，注射器，膠塞及不便局部包裝的用具如金屬器械等，需采用全包裝，現(xiàn)多采用直接裝入鋁飯盒的方法。用鋁飯盒來封裝小培養(yǎng)瓶，膠塞和膠帽等很好，但往往因蓋不嚴(yán)緊使用期限不宜太長。因鋁飯盒不透明，在蓋子宜寫上用品名稱以便于確認(rèn)，吸管在裝入消毒筒之前，先用少許脫脂棉將吸管接口端堵塞，松緊度適宜，過松易脫落，過緊不透氣，妨礙使用;然后裝入消毒筒中，消毒筒底部應(yīng)墊以軟紙或棉花以防吸管裝入時折斷管尖;zui后再包裝入筒中封口。

2.2 注意

包裝之前玻璃器皿蓋子要擰松。

2、 消毒滅菌概念

消毒 具有殺死致病微生物的作用或方法，稱為消毒。通常只能消滅物體表面或環(huán)境中的一部分微生物，有能達到消滅所有微生物。

滅菌 指*殺菌，即用物理或化學(xué)等方法，殺死物體上的一切微生物，以及它們的芽胞和孢子，使物體成為無菌狀態(tài)。

2.1 消毒滅菌方法

2.1.1 物理消毒滅菌法

通過高潮、射線、微波以及器械進行滅菌或除菌的方法均為物理滅菌方法。

(1)紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。

(2)干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱至160℃，保溫90-120 min。用于RNA提取實驗的用品則需180℃，保溫5-8 h。

(3)濕熱滅菌 此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是zui有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手動高壓滅菌鍋操作如下：

①首先查看高壓鍋內(nèi)的水是否充足，放人物品蓋好蓋。

②加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣5—10 min，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。

③待鍋內(nèi)水沸騰后，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。調(diào)節(jié)火力大小保持該壓力。

④停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。

電熱自動滅菌鍋使用說明(型號：SANYO Autoclave MLS-3020)：

①放氣筒加水至LOW水平線處，將與高壓鍋相連的導(dǎo)氣管插入放氣筒里，然后將放氣筒歸于原位。

②打開高壓鍋蓋，加入蒸餾水至高壓鍋底的水位線，水位線位于V型凹槽的1/3-2/3處。

③打開電源。

④設(shè)定高壓溫度及時間，高壓鍋的溫度范圍為105-121℃，高壓滅菌一般采用121℃20—30 min。

⑤把待高壓的物品置于高壓鍋內(nèi)，順時針方向?qū)xhaust鈕旋至close位置。

⑥關(guān)閉高壓鍋蓋，旋至顯示屏上左上角的紅亮點剛出現(xiàn)為止。

⑦按start鈕，開始高壓，在溫度達80℃時顯示器開始顯示溫度，當(dāng)溫度達到所需的設(shè)定溫度時，在顯示屏的左下角有一長形的指示燈閃亮，直到高壓時間結(jié)束后指示燈滅，此時蜂鳴器報警一聲。當(dāng)壓力降至0 MPa時，蜂鳴器再報警一聲。溫度降至80℃時，蜂鳴器報警10次。顯示屏溫度指示消失，此時才可打開鍋蓋。

⑧關(guān)電源，開高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品，烘干。

(4)濾過除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號的金屬濾器(直徑90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動的塑料小濾器(直徑20 mm、25 mm等)。濾膜孔徑有0.60 μm、0.45 μm、0.35 μm、0.22 μm、0.10μm等，以0.22 μm除菌zui為保險，但對于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。

①在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0.22μm。

②用布包好，濕熱滅菌后使用。

2.2.2化學(xué)消毒法

常用的消毒液有如下幾種：

(1)70%(或75%)酒精：超凈臺里常備70%酒精棉球(衛(wèi)生級酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺面的消毒。

(2)0.1%新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺面的清潔。超凈臺旁應(yīng)常備盛有0.1%新潔爾滅溶液的容器及紗布。

(3)來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細胞的消毒處理。使用濃度請按瓶上說明。

(4)0.5%過氧乙酸：是強效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進行。

(5)乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門窗緊閉1—3 d?？蓪⒖諝庵衅〉奈⑸餁⑺?。

(6)37%甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37%甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3 d后方可達到消毒空氣的目的。

3.煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。

五、注意事項

1.清洗玻璃制品時，浸酸之后一定要用自來水沖洗10—15次。因為殘存的洗液對細胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個清洗。如沒有洗凈會影響下一次使用的效果。

2.干熱滅菌時，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當(dāng)溫度超過100℃時，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。.

3.高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。

4.牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。

5.濾過除菌時，濾器在使用前先裝好濾膜(有時可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進行。過濾時壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時位置要準(zhǔn)確。另外濾器包裝時，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。

6.使用化學(xué)消毒法時，配制75%酒精應(yīng)用衛(wèi)生級，不要用化學(xué)純、分析純和純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對皮膚有刺激性。空氣消毒時，所有的物品要事先準(zhǔn)備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因為甲醛或乳酸加熱后放出的蒸氣對人的角膜和呼吸道上皮有嚴(yán)重的刺激和傷害作用。

Ⅱ、培養(yǎng)基的配制

一、 實驗?zāi)康?/span>

熟練掌握培養(yǎng)基(RPMI1640和DMEM)的配制，了解其他培養(yǎng)基配制方法。

二、 實驗原理

組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，它是根據(jù)細胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和其他輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細胞外液相似。小牛血清含有一定的營養(yǎng)成分，更重要的是它含有細胞生長所必須得生長因子、激素、貼附因子等，這是合成培養(yǎng)基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性。故一般體外培養(yǎng)細胞時要加入一定量的小牛血清(10%-20%)。

三、 儀器、材料和試劑

儀器：濾泵一套、濾器一套、蒸餾器、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器。

材料：3000ml錐形瓶、250ml或500ml培養(yǎng)瓶、翻冒塞、飯盒、pH試紙、孔徑0.22μm的微孔濾膜。

試劑：鹽酸、無離子水、小牛血清、合成培養(yǎng)基(RPMI1640)、青霉素、鏈霉素、NaHCO3。

四、 實驗步驟

(一) 準(zhǔn)備和安裝濾器

在超凈工作臺內(nèi)打開包有清洗滅菌好的過濾器的牛皮紙，并架好。膠管一段接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管伸入到已消毒的瓶子中。用濾泵做正壓過濾，壓力數(shù)字為2。過濾后檢查濾膜是否完好無損。

(二) 合成培養(yǎng)基的配制

1、 取3000ml三蒸水，加入合成培養(yǎng)基干粉，用磁力攪拌一定時間(2-4h)使之充分溶解。

2、 通入適量CO2 或加入6mol/L鹽酸調(diào)pH至6.0左右。

3、 加入一定量的NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0左右。

4、 加水至zui終體積。

5、 在超凈工作臺中對溶液進行過濾除菌，分裝入250ml或500ml培養(yǎng)瓶中，用翻冒塞塞緊瓶口。

6、 4℃冰箱儲存(可以-20℃儲存)。

(三) 小牛血清的處理

市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還要做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體。

1、 將血清加熱到56℃并保存30min，期間要不時的輕輕搖晃，使受熱均勻，防止沉淀析出;

2、 處理后的血清儲存于4℃;

3、 小牛血清在使用前進行篩選以掌握血清的質(zhì)量。

(四) 生長培養(yǎng)基的配制

除無血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需要加入一定量的小牛血清和抗生素。

1、培養(yǎng)基分裝成小瓶(100ml-200ml)以便使用，翻冒塞塞緊瓶蓋;

2、按以下比例配制：

基本培養(yǎng)基占80%-90%，小牛血清占10%-20%。

按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使用青霉素和鏈霉素的終濃度分別是100U/ml和100μg/ml。

五、 注意事項

1、 培養(yǎng)細胞使用的瓶子和飯盒應(yīng)與提取RNA和培養(yǎng)細菌的瓶子和飯盒嚴(yán)格分開。因為用于處理提取RNA的DEPC水(0.1%焦炭酸二乙酯)是一種致癌物，可能影響細胞生長;而培養(yǎng)過細菌的用品也不應(yīng)與細胞混用。

2、 過濾時壓力不可過大，否則細菌易濾過達不到除菌效果，或使濾膜破裂。分裝時需根據(jù)使用量的多少選擇合適大小的瓶子，并且每瓶只能裝2/3體積的液體，過多時瓶子易爆或膠塞自噴。

3、 濾器用畢立即刷洗，過蒸餾水，晾干收藏。

Ⅲ、Hanks、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制

一、 實驗?zāi)康?/span>

熟練掌握Hanks、D-Hanks液等平衡鹽溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制方法。

二、實驗原理

Hanks液是常見的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細胞生長狀態(tài)下的pH值、滲透壓及無菌狀態(tài)一致，且配方簡單，是組織培養(yǎng)基本用液，常用于配制培養(yǎng)基及其他用液，或洗細胞等，細胞在BSS中可生存幾個小時。胰蛋白酶(胰酸)溶液是一種常用的細胞消化液，原代培養(yǎng)時用于處理組織塊，使細胞分離下來。傳代時用胰蛋白酶使培養(yǎng)細胞離開所貼附的培養(yǎng)瓶表面，并分散成單個細胞。胰蛋白酶主要采自?；蜇i的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應(yīng)在低溫干燥處保存。胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數(shù)表示，常用胰酶活力為1：125或1：250。本實驗室一般用1：250(GRC公司生產(chǎn))。胰蛋白酶對細胞的分離效果與細胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關(guān)。一般來說濃度大、溫度高(勿高于37℃)、作用時間長，則對細胞分離能力大。但超過一定程度會損傷細胞，導(dǎo)致細胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃時消化能力zui強。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會降低胰酶活力，所以配制胰酶時須用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當(dāng)消化結(jié)束時，可加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶作用。細胞傳代使用的胰酶濃度是0.25%或0.2%。用于原代細胞培養(yǎng)消化組織塊則為0.1%或0.125%。

三、儀器、試劑和材料

材料：3 000 mL錐形瓶，25 mL、50 mL試劑瓶，500 mL輸液瓶，螺口蓋，翻帽塞，pH試紙，孔徑0.22μm的微孔濾膜。

試劑：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚紅，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚紅(0.1%)(配法：稱酚紅2 g，置于研磨器中，先用數(shù)滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加進該5.6%NaHC03溶液使zui終體積為100 mL。瓶裝保存，備用)。

儀器： 抽濾泵1套，過濾器1套，高壓滅菌鍋，量筒，磁力攪拌器，研磨器。

四、實驗步驟

(一)配制D-Hanks液

1.按表2—3—5稱取D-Hanks試劑。

2.依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高壓滅菌，10磅10 min。

(二)配制Hanks液

1.按表2—3—5稱取Hanks試劑。

2.稱取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天時研磨器應(yīng)放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，調(diào)制成糊狀。再放入4℃預(yù)冷的適量D-Hanks液中，4℃下磁力攪拌使*溶解。

3.用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調(diào)至8.0左右(胰酶作用的zui適pH值)，并加入0.02%EDTA以協(xié)助消化作用。

4.濾過除菌(方法見二、培養(yǎng)基的配制)，-20℃凍存。

五、注意事項

1.BSS的pH值應(yīng)確定為7.2左右。

2.如配制的Hanks液高壓滅菌后液體變混，則可將100 mL的CaCl2與含有其他成分的液體分別裝瓶高壓滅菌之后，再在無菌條件下配制，定容。這樣可以避免高壓滅菌后液體變混。

3.胰酶受熱易失活，所以盡量避免盛夏配制，并且在配制過程中溫度應(yīng)始終保持在4℃左右。

4.胰酶研磨要充分，否則在過濾時會將較大的顆粒過濾掉，不能達到真正的濃度。

5.胰酶分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時體積會膨脹，而多次使用同一瓶胰酶反復(fù)凍融會降低消化效果并可能造成污染。

Ⅳ、傳代細胞培養(yǎng)與觀察

一、實驗?zāi)康?/span>

熟練傳代細胞的傳代方法及操作過程。

二、實驗原理

傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。

三、儀器、材料和試劑

儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈臺

材料：培養(yǎng)瓶、試管、移液管、巴士德吸管、廢液缸、75%酒精棉球、酒精燈、培養(yǎng)的細胞。

試劑：培養(yǎng)基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、Hanks液。

四、實驗步驟

1、入無菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒雙手;

2、倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。 將培養(yǎng)用液37℃下預(yù)熱。

3、超凈臺臺面應(yīng)整潔，用75%酒精棉球擦拭清潔;

4、打開超凈工作臺的紫外燈照射臺面20min左右，關(guān)閉紫外燈，打開風(fēng)機清潔空氣出去臭氧;

5、點燃酒精燈;取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。

6、將培養(yǎng)用液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。

7、倒掉培養(yǎng)細胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去殘留的就培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。

8、每個大培養(yǎng)瓶加入1ml胰酶，小培養(yǎng)瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察。當(dāng)細胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細胞提早脫落入消化液中。

9、加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成細胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋好瓶蓋，適度擰緊后稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2的進入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。

10、對懸浮培養(yǎng)細胞，步驟7-9不做。直接將細胞懸液進行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。

五、注意事項

1、傳代培養(yǎng)時注意無菌操作并防止細胞間的交叉污染。所有操作盡量靠近酒精燈火焰。每次只進行一種細胞的操作。每種細胞使用一套器材。

2、每天觀察細胞形態(tài)，掌握好細胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。

3、如發(fā)現(xiàn)細胞有污染跡象，應(yīng)立即采取措施，一般應(yīng)棄置污染的細胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BBS或培養(yǎng)基反復(fù)清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗生素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基。

Ⅴ、細胞的凍存與復(fù)蘇

一、 實驗?zāi)康?/span>

掌握細胞保存的方法，能獨立地進行細胞的凍存與復(fù)蘇操作。

二、實驗原理

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到保種的作用。此外，還可以利用細胞凍存的形式購買、寄贈、交換和運送某些細胞。

細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑——終濃度5%-15% 的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下，在細胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。

采用“慢凍快融”的方法能較好的保證細胞的存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度為-1~-2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃時加速，到-80℃之后直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。復(fù)蘇細胞時則直接將裝有細胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍。

三、儀器、試劑和材料

儀器：4℃冰箱、-70℃冰箱、液氮容器、微量加樣器、水浴鍋、離心機。

材料：凍存管、細胞培養(yǎng)用材料、500ml燒杯、膠布、搪瓷杯、75%酒精棉球。

試劑：培養(yǎng)基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亞砜(DMSO)或甘油、0.5%臺盼籃染液、液氮。

四、實驗步驟

(一)細胞凍存

1、取待凍存的細胞用胰酶消化，用培養(yǎng)基將細胞沖洗下來。800r/min離心5min，棄上清收集細胞。如果是懸浮培養(yǎng)的細胞，可直接離心收集細胞。

2、加入適量凍存液(10%甘油+90%培養(yǎng)基，或是10%DMSO+90%培養(yǎng)基)制成細胞懸液。細胞濃度宜大，3*106個/ml左右，并可適量增加小牛血清濃度至20%。

3、細胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹，做好標(biāo)記(注明細胞種類、時間、條件等)。

4、凍存管在4℃下存放30min，轉(zhuǎn)放-20℃1.5h~2h，再轉(zhuǎn)入-70℃4~12h后即可轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)(-196℃)，注意進行登記。

(二)細胞復(fù)蘇

1、取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2、從液氮中取出凍存管立即投入40℃水中迅速解凍。

3、取出凍存管，用75%酒精清潔管口，打開。

4、離心去上清收集細胞，用無血清培養(yǎng)基洗1次，加入3ml新鮮培養(yǎng)基，于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

5、每日觀察細胞生長情況，如果死細胞較多，復(fù)蘇次日應(yīng)換液。待細胞長滿后進行傳代培養(yǎng)。

五、注意事項

1、在使用含有DMSO的凍存液時，因為DMSO在室溫狀態(tài)易損傷細胞，所以在細胞加入凍存液后應(yīng)盡快放入4℃環(huán)境中。

2、準(zhǔn)確記錄細胞的種類、凍存時間、凍存液的品種和凍存者信息。

小結(jié)：這里總結(jié)了動物細胞培養(yǎng)的從器材消毒、試劑配制、細胞的凍存復(fù)蘇操作技術(shù)，希望對大家有用。