應(yīng)用半制備液相色譜分離制備高純度苜蓿素

竹茹Bambusae Caulisin Taenias作為藥食兩用的藥材，在《中藥辭?！分杏涊d為禾本科剛竹屬、箣竹屬和牡竹屬中一些竹種的莖稈所刮下的外皮層或其次一層，具有清熱化痰、除煩止嘔等功效，常用于治療熱痰引起的痰熱咳嗽、痰火挾痰、煩熱嘔吐等病癥，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為中品，《藥品化義》曰：“竹茹輕可去實(shí)，涼能去熱，苦能降下，專清痰，為寧神開(kāi)郁佳品”，是臨床*的常用藥，收載于《中國(guó)藥典》2010年版。

苜蓿素（tricin），又稱麥黃酮、小麥黃素，化學(xué)名稱為5, 7, 4′-三羥基-3′, 5′-二甲氧基黃酮。苜蓿素在苜蓿[3]、大麥[4]、竹葉[5]、地膽草[6]、軟蒺藜[7]、野菊花[8]等植物中多有檢出。Hudson等[9]的研究表明苜蓿素能有效抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468和人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長(zhǎng)。Cai等[10]進(jìn)一步研究了苜蓿素對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞株的體外生長(zhǎng)抑制及其細(xì)胞周期抑制作用。然而，除了癌癥防護(hù)之外，已知關(guān)于苜蓿素藥理活性研究的報(bào)道不多，部分原因在于獲得苜蓿素單體較困難。目前，苜蓿素單體主要來(lái)源于化學(xué)合成，從天然植物中分離制備較大量的苜蓿素的相關(guān)報(bào)道很少，市場(chǎng)上更無(wú)苜蓿素對(duì)照品出售。本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)色譜和半制備液相色譜結(jié)合的方法制備苜蓿素對(duì)照品。該法簡(jiǎn)便易行，所制備的對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)98%以上。

2  方法與結(jié)果

2.1  原料處理竹茹5.5 kg，粉碎至10～20目，采用50%乙醇熱回流提取1.5 h，提取兩次，合并提取液，減壓濃縮成膏狀，得膏狀物145 g，取50 g上40～60目已處理完畢的聚酰胺樹(shù)脂，依次采用3倍柱體積10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脫，分別收集樣品、濃縮和凍干，經(jīng)液相色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)70%乙醇洗脫物制備苜蓿素對(duì)照品。

2.2  色譜條件

2.2.1  分析色譜條件

色譜柱為Luna C18ODS（250 mm×4.6 mm，5 µm），流動(dòng)相為乙腈（A）-1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫條件：0～15 min，15% A；15～25 min，15%～40% A；25～34 min，40% A；34～40 min，40%～15% A；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm。

2.2.2  半制備色譜條件 

色譜柱為Luna C18ODS（250 mm×10 mm，10 µm），流動(dòng)相為乙腈-1%甲酸水溶液（35∶65）；體積流量4 mL/min；進(jìn)樣量1 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm。2.3  苜蓿素對(duì)照品的制備將70%乙醇洗脫物溶解于甲醇中，制成10 mg/mL的樣品，經(jīng)濾膜（0.45 µm）濾過(guò)后備用，半制備型HPLC分離制備，收集保留時(shí)間為18.5～19.5 min的組分（圖1），將其減壓濃縮干燥（60 ℃以下），zui后冷凍干燥得到淡黃色粉末170 mg，經(jīng)峰面積歸一法計(jì)算，制備所得的對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.1%，竹茹中含苜蓿素69.60 μg/g，得率約為44.10%，苜蓿素對(duì)照品的HPLC圖譜見(jiàn)圖2。

1. 討論

在進(jìn)行液相半制備色譜制備前，先將提取物通過(guò)聚酰胺柱色譜預(yù)處理，在采用10%、30%、50%乙醇洗脫以后，去除了提取物中大量的雜質(zhì)和一些極性較大的黃酮和酚酸類化合物，使極性較低的苜蓿素得到了進(jìn)一步的富集。分析色譜發(fā)現(xiàn)苜蓿素在30 min左右出峰，乙腈體積分?jǐn)?shù)在40%，為 了盡量減少目標(biāo)峰與前后雜質(zhì)峰重疊的可能性，并兼顧單次實(shí)驗(yàn)時(shí)間和試劑使用量，因此采用了35%乙腈等度洗脫，既能達(dá)到目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的極限分離，又能盡可能地節(jié)約時(shí)間和試劑。選用甲醇-水系統(tǒng)，苜蓿素保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，且分離效果不佳；選用乙腈-水系統(tǒng)，有主峰與雜質(zhì)峰重疊現(xiàn)象出現(xiàn)，并伴有拖尾現(xiàn)象發(fā)生，因此選用乙腈-酸水系統(tǒng)。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用乙酸時(shí)，苜蓿素有較好的分離效果，甲酸稍差，因此在分析測(cè)試時(shí)采用乙腈-1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相；但乙酸沸點(diǎn)較高，不易蒸發(fā)，會(huì)引起產(chǎn)品純度降低，因此在制備過(guò)程中選用乙腈-1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，甲酸沸點(diǎn)與水相近，易與水一起蒸出，不會(huì)引起產(chǎn)品純度降低。單純的柱色譜分離得到的粗品含有多種微量雜質(zhì)，純度達(dá)不到對(duì)照品的要求。而通過(guò)其他方法純化比較繁瑣，通過(guò)液相半制備色譜多個(gè)紫外波長(zhǎng)的檢測(cè)，方法操作方便，可使苜蓿素峰和雜質(zhì)峰分開(kāi)，進(jìn)而使得對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到98%以上。張銳等[15]結(jié)合硅膠柱色譜和制備HPLC法對(duì)竹根醋酸乙酯部位進(jìn)行分離純化，得到了質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%苜蓿素對(duì)照品，方法相對(duì)簡(jiǎn)便，制備成本較低，*的不足就是硅膠柱色譜洗脫時(shí)，需要使用較大量的有機(jī)洗脫試劑。而本實(shí)驗(yàn)建立的制備苜蓿素對(duì)照品的方法，采用聚酰胺樹(shù)脂吸附解析，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為洗脫試劑，不僅操作方便，重現(xiàn)性好，而且制備的產(chǎn)品純度高，可用于分析用的對(duì)照品，而且避免了有機(jī)試劑的大量使用。