酵母菌

玻璃珠破菌緩沖液

玻璃珠拍打器

1.  培養(yǎng)并收集酵母菌細(xì)胞，在酵母消解酶緩沖液重懸菌體沉淀之前，測(cè)定壓緊細(xì)胞的體積，以下所有步驟均在4℃進(jìn)行。

2.  用1體積的玻璃珠破菌緩沖液重懸細(xì)胞。

3.  用2體積的玻璃珠破菌緩沖液與細(xì)胞混合，加4體積冰冷的酸洗玻璃珠。

4a.  當(dāng)壓緊的細(xì)胞休積＜10 ml，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至合適大小的帶螺口的離心管中（懸液占離心管≤60%~70%的容積），于4℃以zui大速度下振蕩30~60 s，將管置于冰上放置1~2 min，重復(fù)3~5次，在顯微鏡下檢査破細(xì)胞的程度，繼續(xù)步驟5。

4b.  當(dāng)壓緊的細(xì)胞體積＞10 ml，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到合適大小的玻璃珠攪拌容器中（建議用導(dǎo)熱性能好的不銹鋼材料）并加玻璃珠破菌緩沖液至容器的邊緣，但加到容器中的緩沖液不超過(guò)1個(gè)細(xì)胞懸液的體積。裝好攪拌桿和螺蓋，確保將容器中所有空氣排盡（排除空氣以防止起泡和蛋白質(zhì)變性這一點(diǎn)非常重要），高速攪拌60 s，冰上放置1~2 min，重復(fù)3~5次。

5.  沉淀玻璃珠，輕輕倒出上清，加入2~4體積的玻璃珠破菌緩沖液，顛倒管5~10次，待玻璃珠沉淀后輕輕倒出上清，合并上清液。

6.  合并的上清液于4℃，12 000 g 離心60 min，收集上清即為抽提液。長(zhǎng)期貯存時(shí)，將其分成小份于液氮中快速冷凍，-80℃貯存。