通過本試驗，了解食品檢驗中水質微生物檢測的基本方法。

一、水樣的采集

1.自來水

先將水用清潔布拭干，并用攝子夾消毒棉花沾酒精灼燒水3min滅菌，再打開水使水流5min后，以滅菌的三角瓶或生理鹽水瓶接取水樣，以待檢測。

2.池水、河水或湖水

應取距水面10～15cm的深層水，先將滅菌的帶塞的玻璃瓶瓶口向下浸入水中，然后翻轉過來，除去瓶塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞塞好，再從水中取出，立即檢驗，否則需放入冰箱保藏。

二、細菌菌落總數(shù)測定（SPC）

1.樣品稀釋與制備

（1）自來水：用滅菌吸管吸取1mL 水樣，注入滅菌的培養(yǎng)皿中，共做兩個平皿。然后倒入約15 mL已溶化并冷卻至45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并輕輕搖晃，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。待冷卻后倒置于36±1℃培養(yǎng)24h，進行菌落計數(shù)。

（2）池水、河水或湖水等：用無菌吸管吸取檢測水樣1mL于*支9mL生理鹽水試管中，搖勻，再從第1支稀釋試管中吸取1mL于第2支生理鹽水的試管中，如此類推，做成一系列的稀釋液。一般稀釋度可選擇為10-1、10-2、10-3、10-4，若水樣混濁或污染嚴重的可再進一步稀釋至適宜稀釋度。自zui后三個稀釋度的試管中各吸取1mL稀釋液于培養(yǎng)皿中，每稀釋度做二個平皿，傾注入約15mL 已溶化并冷卻至45℃左右的營養(yǎng)瓊脂，并輕晃平皿，使之混勻，待冷卻后倒置于36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h?！?/span>

2.菌落計數(shù)方法

待平皿培養(yǎng)24h長出菌落后作平皿菌落計數(shù)，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏，在記下各皿的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的2個平皿的平均菌落數(shù)。

    3.菌落計數(shù)的報告：

    ①平皿菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30～300之間的平皿作為菌落總數(shù)測定標準，一個稀釋度使用兩個平皿應采用其平均數(shù)，其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可計算半個平皿后乘2以代表全皿菌落數(shù)。

②稀釋度的選擇：　

a.應選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表例1)。

b.若有兩個稀釋度，其生長之菌落數(shù)均在30～300之間，則應視二者之比如何來決定，若其比值小于2，應報告其平均數(shù)：若大于2則報告其中較小的數(shù)字(見表例2及3)。

c.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應按稀釋度zui高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表例4)

d.若所有釋稀度的平均菌落數(shù)均小于30，則應按稀釋倍數(shù)zui低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表例5)。

e.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以zui接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表例6)。

    f.若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于(＜)1乘以zui低稀釋倍數(shù)報告之(見表例7)。

　　   　　　　　　　　　　細菌菌落總數(shù)計算方法（SPC法）

③菌落數(shù)的報告：菌落數(shù)小于10，按＜10報告；在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告；大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示。

    三、大腸菌群檢驗：

    大腸菌群系指一群在36±1℃24h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧G-無芽孢桿菌，包括埃希氏大腸桿菌、克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌和檸檬酸桿菌等。該菌群主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價水質的衛(wèi)生質量，具有廣泛的衛(wèi)生學意義。

水中大腸菌群數(shù)系以每1L水樣中大腸菌群zui近似數(shù)(M.P.N)個表示。

瓶裝水、飲用水、水源水和游泳池水衛(wèi)生標準

1. 生活飲用水或食品廠生產(chǎn)用水的檢驗：

（1）初步發(fā)酵試驗

在2個各裝有50mL 叁倍濃縮的十二烷基硫酸鈉乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入100 mL水樣，將10支含有5mL叁倍乳糖蛋白胨發(fā)酵管中各加入10mL水樣，于36±1℃培養(yǎng)24h，24h未產(chǎn)氣者繼續(xù)培養(yǎng)至48h。若水質條件變化不大的飲用水（或生產(chǎn)用水）可采用3個裝有50mL 叁倍濃縮的十二烷基硫酸鈉乳糖蛋白胨發(fā)酵管分別加入100mL 水樣。

  （2）分離培養(yǎng)

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別接種在伊紅美蘭瓊脂平板，置36±1℃培養(yǎng)18～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，凡菌落或菌苔符合深紫黑色，有金屬光澤；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；淡紫紅色，中心顏色較深或紫紅色菌落特征的均應進一步作革蘭氏染色和證實試驗。

  （3）證實試驗

在上述平板上，挑取在此平板生長符合上述特征的菌落，或可疑無法判斷的菌落1～2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性；如乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色陽性，則報告為大腸菌群陰性。

（4）根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查下列表。

飲用水大腸菌群檢索表（接種水樣總量300mL，其中100mL2份，10mL10份）

大腸菌群變異不大的飲用水檢索表

2．池水、河水或湖水等水源水的檢驗

將水樣稀釋成10-1、10-2。分別吸取1mL的 10-1、10-2的稀釋水樣和1mL原水樣，各注入裝有10mL單料乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，另取10mL原水樣注入裝有5mL叁倍十二烷基硫酸鈉乳糖蛋白胨發(fā)酵管中（接種水量為11.11mL，若水源水嚴重污染則取樣量應為1.111mL，即原水樣、10-1、10-2、10-3；若污染輕度水取樣為111.1mL，即100倍原水樣、10倍原水樣、原水樣和10-1）。置36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況，若有產(chǎn)氣者則按上述的分離培養(yǎng)與證實試驗進行，zui后根據(jù)產(chǎn)氣管數(shù)查表報告。

四、培養(yǎng)基配方

（1）生理鹽水　　　　NaCl　　9g      水　1000mL

（2）伊紅美蘭培養(yǎng)基（EMB）

蛋白胨水瓊脂培養(yǎng)基　　100mL （蛋白胨　10g　NaCl  5g  瓊脂20g       水1000mL  pH7.6  121℃20min）

　　乳糖　2g　　2%伊紅液　2mL　　0.65%美蘭液　1mL　

將已滅菌的蛋白胨水瓊脂溶化，冷卻至60℃左右時，按無菌操作加入乳糖、伊紅液和美蘭液（這三種應分別在115℃滅菌20min），搖勻后倒平板。

（3）乳糖發(fā)酵液（供復發(fā)酵用）

　　蛋白胨　10g　　乳糖　5g　　NaCl  5g  　水　1000mL　  pH7.4

1. 營養(yǎng)瓊脂

蛋白胨　10g　　牛肉膏　3g　　NaCl  5g　　瓊脂　20g  水　1000mL 　 pH7.0-7.2　　121℃　20min。

（5）單料十二烷基硫酸鈉乳糖發(fā)酵液配方：

蛋白胨　10g　　　牛肉膏　　3g　　　乳糖　　5 g　　　NaCl   5g

1.6%溴甲酚紫乙醇液　　1mL  　　　十二烷基硫酸鈉　0.1g

　　水　　1000mL　　pH7.2～7.4

將上述除指示劑外溶于水，調pH7.2～7.4，再加入指示劑。

（6）叁料十二烷基硫酸鈉乳糖發(fā)酵液配方：

按單料十二烷基硫酸鈉乳糖發(fā)酵液配方要求各營養(yǎng)成分為叁倍，而加水不變。

水源水大腸菌群檢索表

接種水量11.11mL，分別為10、1、0.1 和0.01mL各1份

若接種水量為111.1mL則上述數(shù)字減少10倍，若接種水量為1.111mL則上述數(shù)字增加1