石蠟切片的酶免疫組化注意事項(xiàng)      

                                                            北京海德生物公司  

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一.    石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？  

一般來說，如果用多聚賴氨酸包被過的片子做正常免疫組織化學(xué)染色的話是不會掉片子的。但如果要做抗原修復(fù)的話，如果片子處理不好的話是有可能掉片子的。你可以試試一下的方法： 

1.一般用APES：丙酮=1:50的處理液來處理片子，處理5min左右，然后水洗，烘干既可用于貼片。如果把水滴在處理好的片子上，水比較聚的話說明片子處理的好。 

2.貼片子的時(shí)候，展片的時(shí)間要把握好，不要太長，否則不利于貼牢。 

3.烤片子也很重要，切好的片子先不要馬上收起來，而是水平至于烘片臺上37度兩個(gè)小時(shí)以上，一是水分*烘干。然后做染色前再在60度烘箱烘1個(gè)小時(shí)。 

4.再補(bǔ)充一點(diǎn) 

，石蠟包埋時(shí)，酒精梯度脫水以及浸蠟等一點(diǎn)要充分，這對貼片也有影響。 

如果這些導(dǎo)致掉片的因素都已經(jīng)排除但是片子還是掉的厲害，那么也可能是以下原因造成的： 

1、多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。

    2、組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。 

3、組織的問題，一般癌癥組織有壞死之類越容易脫。 

4、沒烤好，時(shí)間短溫度不夠之類。 

5、操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。 

6、修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過長了，或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時(shí)手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時(shí)候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。 

此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹(jǐn)慎，用PBS的時(shí)候盡量用泡的，不要沖?；旧习堰@些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。 

二. DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？ 

著色不均勻可能與你的實(shí)驗(yàn)手法有很大關(guān)系，可能原因有： 

1.切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。 

2.有可能顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后將片子來回左右晃動幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。 

3.如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。zui外側(cè)的組織片離顯色液外緣0.5cm。 

三.  

切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？ 

a.也許是抗體本身有問題，因?yàn)橛泻芏喙镜目贵w質(zhì)量并不好，很容易上背景，可以換一種抗體試試。 

b.如果經(jīng)費(fèi)不允許換抗體的話，你可降低抗體的濃度，并隨時(shí)注意觀察顯色，在能看到信號的情況下盡量降低背景。 

c.可以換一種封閉液，不同的封閉液對某種來源的抗體來說，會有不同的封閉效果。 

d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所檢測動物組織的正常血清，這樣可以去除一部分非特異性染色。 

全片著色 

全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色，著色的強(qiáng)度可深可淺，總之，分不清哪些組織是陽性哪些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有： 

（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色。 

（2）抗體孵育時(shí)間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。 

（3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長：DAB現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會 游離出 氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到 理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過長。 

（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。 

（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組 化染 色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4?C冰箱，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太 長。 

（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時(shí)設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。 

四. 免疫組化結(jié)果老是出現(xiàn)陰性結(jié)果？ 

免疫組化出現(xiàn)陰性結(jié)果有可能組織本身就沒有信號，也有可能是抗體出了問題?？梢哉乙恍╆栃越M織做一下，以確定是抗體的問題還是組織本身就沒有所檢測的抗原表達(dá)。還有，可以提高抗體的濃度，或者試一試抗原修復(fù)等方法，也許會得到意想不到的結(jié)果。 

五. 一抗從4度拿出后，為什么有人說要37度復(fù)溫，目的是什么？ 

1. 一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片； 

2. 另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達(dá)較弱的抗原可能有用,4度和37度時(shí)分子運(yùn)動方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。 

六. 免疫組化中抗原修復(fù)的*條件是什么？尤其是微波修復(fù)。 

關(guān)于抗原修復(fù)，我個(gè)人的觀點(diǎn)和panther75有點(diǎn)不同。我試過的修復(fù)條件有EDTA熱修復(fù)，檸檬酸鈉為緩沖液的微波修復(fù)以及高壓鍋修復(fù)。從我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 來看，微波修復(fù)其實(shí)很不容易掉片子的，而EDTA熱修復(fù)和高壓鍋修復(fù)是很容易掉片子的。因?yàn)榈羝又饕且驗(yàn)榧訜徇^程中產(chǎn)生的氣泡所引起，而微波修復(fù)水加 熱到沸騰，沾在片子上的氣泡就會少，不會因?yàn)樾馀萆洗鹈撈?。做EDTA修復(fù)時(shí)，你可以將片子靠的盡量近些，或是在載玻片四周墊些棉花什么的，然后蓋 上蓋玻片，這樣修復(fù)的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。 

我們用的微波修復(fù)條件為： 

2.94g檸檬酸三鈉溶于1000ml的水，調(diào)ph值至6.0，微波修復(fù)10分鐘。你可以試試，時(shí)間可以根據(jù)需要自己調(diào)整。 

七. 有人在一抗孵育前用tritonX100來通透細(xì)胞，對石蠟切片需要否？ 

用石蠟切片做免疫組化是不需要透膜處理的，一是因?yàn)槭炃衅容^薄，另外一個(gè)原因我認(rèn)為是在包埋過程中細(xì)胞膜已經(jīng)被破壞，所以這一步可以省略。 

八. 蘇木素復(fù)染的時(shí)間應(yīng)該是多少？復(fù)染過度咋辦？ 

復(fù)染時(shí)間不需要太長，當(dāng)然這也要根據(jù)蘇木精的質(zhì)量來確定，但基本上不要超多一分鐘。染色過深的話可以用酸性的水溶液（在水里滴加少量濃鹽酸）分色，分色的另 外一個(gè)目的是洗掉蘇木精在細(xì)胞質(zhì)中的非特異性結(jié)合，這樣可以使細(xì)胞質(zhì)中的特異信號更明顯。所以不管復(fù)染是不是過度，分色這一步不要省掉。分色后記得再 用氨水返藍(lán)一下。