1.細(xì)胞培養(yǎng)物上清:
細(xì)胞培養(yǎng)物于室溫1000g,離心10分鐘后收集上清,并將標(biāo)本保存于-20℃,且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血清:
標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g,4℃離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.血漿:
可用EDTA或肝素作為抗凝劑標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃,1000g離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4.尿液:
無菌收集取初尿,離心除去沉淀物,即可用于檢測,要長期保存尿樣,可以加入0.05%的NaN3在4-8℃保存,或加入尿樣冰凍保護(hù)液放入-20℃冰箱長期保存。
5.組織勻漿:
將組織標(biāo)本先用PBS洗滌,除去多余血液,勻漿化后放在PBS于-20℃放置過夜,再經(jīng)過二次反復(fù)凍融破膜,5000g,4℃離心5分鐘,取上清即可檢測。
ELISA法定量檢測人細(xì)胞液、體液以及組織勻漿中8羥基脫氧鳥苷的含量。
試劑組成:包被平底微孔板,酶結(jié)合物,生物素,標(biāo)準(zhǔn)品,顯色劑A,顯色劑B,終止液,濃縮洗滌液(100倍稀釋),使用說明書
自備物品
1.酶標(biāo)儀(盡量提前預(yù)熱)
2.微量加液器、吸頭
3.蒸餾水或去離子水以及濾紙
樣本的采集及保存
一般的生物標(biāo)本包括有:
血液、體液、內(nèi)臟器官、糞便、胃液、活檢組織、組織提取液、天然孔分泌物及各種表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物等
一般為無菌操作,低溫保存(-80℃、液氮)
一.如果采集的實(shí)質(zhì)器官則要求:
1、器官實(shí)質(zhì)不能太小
2、以采集實(shí)質(zhì)性病灶區(qū)為佳:如淋巴結(jié)、心臟、非、肺、脾以及腸管等病毒、病菌聚集的地方為佳
3、同一病例裝入同一容器,并做好標(biāo)記
4、應(yīng)在0-8℃的低溫儲存和運(yùn)輸
5、實(shí)質(zhì)性器官的處理:
5.1、取實(shí)質(zhì)性器官約0.5mg左右,充分剪碎或研磨
5.2、加入約500ul的PBS/生理鹽水,充分混勻
5.3、離心5000rmpx10min,去上清
5.4、-20℃保存,作為待檢標(biāo)本(切勿反復(fù)凍融)
二.體液(常見的包括血清、血漿、唾液以及尿液等)的處理方式
1、血液包括血漿和血清,它們的主要區(qū)別就是:血清凝血而血漿不凝血,所以它們的處理方式也就不一樣
1.1、采集血漿時一般不加抗凝劑(主要為枸櫞酸鹽和檸檬酸鹽),采集后立即離心800-1000rmpx5min分離,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?br />
1.2、如要采集血清,一般要加入總體積1%的抗凝劑,采集后先室溫或4℃靜置半小時后,800-1000rmpx5min分離,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?br />
2、胃液和唾液的采集方式一般現(xiàn)采現(xiàn)用,但是一般飯后半小時內(nèi)不易采集,因為剛進(jìn)食的唾液中富含豐富的唾液淀粉酶,的采集的時間時空腹采集;
3、尿液的采集方式基本和唾液一樣的,即現(xiàn)采現(xiàn)用,但是一般隔夜尿不采集;
4、組織提取液如肺泡灌洗液等,采集后離心分離,800-1000rmpx5min,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?br />
三.糞便以及天然孔排泄物:采集后一般現(xiàn)用PBS/生理鹽水溶解,充分混勻,800-1000rmpx5min分離,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?br />
四.活檢組織一般進(jìn)行穿刺檢測,zui常見的就是肝活檢,像病毒性肝炎、脂肪肝、各種類型的肝硬化等進(jìn)行活檢簡單方便、準(zhǔn)確。
三、表達(dá)產(chǎn)物的檢測
(一)真核表達(dá)產(chǎn)物
1、細(xì)胞上清(分泌性蛋白)
1.2、貼壁細(xì)胞或半貼壁,直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清吸出,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
1.2、不貼壁細(xì)胞,將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml離心管,500-800rmpx10min,吸取上清至另一10ml離心管中,10000rmpx10min,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
2、細(xì)胞裂解物(非分泌性蛋白)
2.1、貼壁細(xì)胞或半貼壁,直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清吸出,然后用001MPBS(pH7.4)將細(xì)胞吹下至10ml離心管,500-800rmpx10min,棄上清,沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中,DDW重懸,置冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
2.2、不貼壁細(xì)胞,將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml離心管,500-800rmpx10min,棄上清,沉淀移至另一10ml離心管中,0.01MPBS(pH7.4)重懸,500-800rmpx10min,棄上清,沉淀移至1.5ml離心管中,DDW重懸,置冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
?。ǘ┰耍ù竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)產(chǎn)物
1、表達(dá)上清(非融合性蛋白)
直接將培養(yǎng)物和上清吸出,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
2、菌體裂解物(融合性蛋白)
直接將培養(yǎng)物和上清吸出,10000rmpx10min,棄上清,沉淀用PBS洗一遍,500-800rmpx10min,棄上清,DDW重懸沉淀,冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
細(xì)胞培養(yǎng)物于室溫1000g,離心10分鐘后收集上清,并將標(biāo)本保存于-20℃,且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血清:
標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g,4℃離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.血漿:
可用EDTA或肝素作為抗凝劑標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃,1000g離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4.尿液:
無菌收集取初尿,離心除去沉淀物,即可用于檢測,要長期保存尿樣,可以加入0.05%的NaN3在4-8℃保存,或加入尿樣冰凍保護(hù)液放入-20℃冰箱長期保存。
5.組織勻漿:
將組織標(biāo)本先用PBS洗滌,除去多余血液,勻漿化后放在PBS于-20℃放置過夜,再經(jīng)過二次反復(fù)凍融破膜,5000g,4℃離心5分鐘,取上清即可檢測。
ELISA法定量檢測人細(xì)胞液、體液以及組織勻漿中8羥基脫氧鳥苷的含量。
試劑組成:包被平底微孔板,酶結(jié)合物,生物素,標(biāo)準(zhǔn)品,顯色劑A,顯色劑B,終止液,濃縮洗滌液(100倍稀釋),使用說明書
自備物品
1.酶標(biāo)儀(盡量提前預(yù)熱)
2.微量加液器、吸頭
3.蒸餾水或去離子水以及濾紙
樣本的采集及保存
一般的生物標(biāo)本包括有:
血液、體液、內(nèi)臟器官、糞便、胃液、活檢組織、組織提取液、天然孔分泌物及各種表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物等
一般為無菌操作,低溫保存(-80℃、液氮)
一.如果采集的實(shí)質(zhì)器官則要求:
1、器官實(shí)質(zhì)不能太小
2、以采集實(shí)質(zhì)性病灶區(qū)為佳:如淋巴結(jié)、心臟、非、肺、脾以及腸管等病毒、病菌聚集的地方為佳
3、同一病例裝入同一容器,并做好標(biāo)記
4、應(yīng)在0-8℃的低溫儲存和運(yùn)輸
5、實(shí)質(zhì)性器官的處理:
5.1、取實(shí)質(zhì)性器官約0.5mg左右,充分剪碎或研磨
5.2、加入約500ul的PBS/生理鹽水,充分混勻
5.3、離心5000rmpx10min,去上清
5.4、-20℃保存,作為待檢標(biāo)本(切勿反復(fù)凍融)
二.體液(常見的包括血清、血漿、唾液以及尿液等)的處理方式
1、血液包括血漿和血清,它們的主要區(qū)別就是:血清凝血而血漿不凝血,所以它們的處理方式也就不一樣
1.1、采集血漿時一般不加抗凝劑(主要為枸櫞酸鹽和檸檬酸鹽),采集后立即離心800-1000rmpx5min分離,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?br />
1.2、如要采集血清,一般要加入總體積1%的抗凝劑,采集后先室溫或4℃靜置半小時后,800-1000rmpx5min分離,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?br />
2、胃液和唾液的采集方式一般現(xiàn)采現(xiàn)用,但是一般飯后半小時內(nèi)不易采集,因為剛進(jìn)食的唾液中富含豐富的唾液淀粉酶,的采集的時間時空腹采集;
3、尿液的采集方式基本和唾液一樣的,即現(xiàn)采現(xiàn)用,但是一般隔夜尿不采集;
4、組織提取液如肺泡灌洗液等,采集后離心分離,800-1000rmpx5min,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?br />
三.糞便以及天然孔排泄物:采集后一般現(xiàn)用PBS/生理鹽水溶解,充分混勻,800-1000rmpx5min分離,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?br />
四.活檢組織一般進(jìn)行穿刺檢測,zui常見的就是肝活檢,像病毒性肝炎、脂肪肝、各種類型的肝硬化等進(jìn)行活檢簡單方便、準(zhǔn)確。
三、表達(dá)產(chǎn)物的檢測
(一)真核表達(dá)產(chǎn)物
1、細(xì)胞上清(分泌性蛋白)
1.2、貼壁細(xì)胞或半貼壁,直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清吸出,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
1.2、不貼壁細(xì)胞,將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml離心管,500-800rmpx10min,吸取上清至另一10ml離心管中,10000rmpx10min,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
2、細(xì)胞裂解物(非分泌性蛋白)
2.1、貼壁細(xì)胞或半貼壁,直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清吸出,然后用001MPBS(pH7.4)將細(xì)胞吹下至10ml離心管,500-800rmpx10min,棄上清,沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中,DDW重懸,置冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
2.2、不貼壁細(xì)胞,將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml離心管,500-800rmpx10min,棄上清,沉淀移至另一10ml離心管中,0.01MPBS(pH7.4)重懸,500-800rmpx10min,棄上清,沉淀移至1.5ml離心管中,DDW重懸,置冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
?。ǘ┰耍ù竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)產(chǎn)物
1、表達(dá)上清(非融合性蛋白)
直接將培養(yǎng)物和上清吸出,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
2、菌體裂解物(融合性蛋白)
直接將培養(yǎng)物和上清吸出,10000rmpx10min,棄上清,沉淀用PBS洗一遍,500-800rmpx10min,棄上清,DDW重懸沉淀,冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行檢測,如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;
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