摘要：

近年來，流式細胞分選和激光捕獲顯微切割技術(shù)的出現(xiàn)讓單細胞的捕獲成為可能。不過，在獲得目的細胞之后，如何與下游分析技術(shù)（如新一代測序和芯片）銜接呢？單個細胞只含有pg級的DNA，細菌更是只有fg級的DNA，但測序或芯片分析通常需要μg甚至mg級的DNA。怎么辦？讓全基因組擴增來幫忙！

在細胞分析中，我們往往采用細胞群體，來獲取某個參數(shù)的平均值。然而，隨著細胞生物學(xué)的發(fā)展，我們逐漸意識到，平均值已不再能滿足我們的要求。對于一些復(fù)雜的組織，群體性研究只能獲得某些數(shù)量上占優(yōu)勢的細胞信息，比如高度異質(zhì)性的實體瘤組織。同時，還有一些細胞的量極少，如產(chǎn)前診斷中的胎兒細胞或循環(huán)腫瘤細胞。當然，別忘了自然界還存在各種各樣的微生物。其中，大部分微生物不僅數(shù)量有限，也無法用傳統(tǒng)的方法擴大培養(yǎng)。對于這些微量細胞的分析，常規(guī)的技術(shù)顯然束手無策。

全基因組擴增（whole gemome amplification）是對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術(shù)，其目的是在沒有序列偏向性的前提下大幅度增加DNA的總量。之前人們常用基于PCR的擴增方法（如DOP-PCR和PEP-PCR），但這些方法不能對各個片段進行均勻地擴增，有可能產(chǎn)生擴增假象。因此，目前人們多采用多重置換擴增（MDA）方法。

號稱基因組復(fù)印機的QIAGEN REPLI-g試劑盒正是基于多重置換擴增技術(shù)，對有限的樣品進行快速、均勻、無偏向的等溫全基因組擴增，從而獲得更多遺傳信息。原理是什么？請看圖1。

圖1. 多重置換擴增（MDA）技術(shù)

在擴增過程中，引物與模板DNA 退火，并利用在DNA 模板鏈上移動的Phi 29 聚合酶在30°C 延伸，取代互補鏈，同時自身成為復(fù)制的模板。與PCR 擴增不同，MDA 不需要不同的溫度，且zui終的片段非常長（2-70 kb），突變率低。

之前QIAGEN已有多款REPLI-g試劑盒，而新品REPLI-g Single Cell Kit則是專為單細胞研究人員而設(shè)計的。與之前的試劑盒相比，它有兩點不同：采用優(yōu)化配方的高保真Phi 29 聚合酶；增加了UV去污染步驟。

REPLI-g sc 聚合酶是高保真Phi 29 聚合酶的優(yōu)化配方，具有強的置換活性，可通過多重置換擴增（MDA）擴增復(fù)雜的基因組DNA，而溫和的堿變性步驟可防止DNA 片段化并產(chǎn)生脫堿基位點。Phi 29 聚合酶確保了基因座的均勻擴增，它zui多能復(fù)制70 kb 而不與基因組DNA 模板解離，實現(xiàn)了基因座的均勻擴增。Phi 29 聚合酶有著3’ → 5’ 的核酸外切酶校正活性，在復(fù)制時其保真度比Taq DNA 聚合酶高出1000 倍，從而避免了擴增偏向或突變。相比之下，那些基于PCR的擴增方法會導(dǎo)致擴增片段短且容易出錯，帶來單堿基對突變、STR縮小和擴大。

同時，REPLI-g Single Cell Kit 使用專門的緩沖液和試劑，反應(yīng)設(shè)置相當簡單，且處理時間僅為15 分鐘。這些*的組分，再加上標準化的UV 處理步驟，能夠消除任何可檢測到的殘留DNA污染，確保高質(zhì)量結(jié)果僅僅來自您那個寶貴的細胞。此試劑盒也可使用已純化的基因組DNA、新鮮或干燥的血液，以及新鮮或冷凍的組織。

表1. REPLI-g Single Cell Kit的組分

這下，哪怕只有一個細胞在手，您也可以大膽地開展各種下游分析了吧。經(jīng)REPLI-g Single Cell擴增后，DNA產(chǎn)物平均長度超過10 kb，產(chǎn)量高達40 μg，且完整覆蓋基因組，高度適合也已經(jīng)開發(fā)用于新一代測序（NGS）、芯片法比較基因組雜交（array CGH）或qPCR分析。

圖2. 完整的基因組覆蓋。利用RT2 qPCR Primer Assays（QIAGEN）以及REPLI-g Single Cell Kit 在3 個不同的單細胞實驗中擴增DNA 后開展實時定量PCR，對整個人類基因組中分布在不同染色體上的267 個基因座進行全面分析。低且一致的CT 值、無任何標記的丟失，表明基因組中所有區(qū)域的成功擴增，高度適合單細胞基因組學(xué)。

當然，事實勝于雄辯。東西好不好，用過了才有發(fā)言權(quán)。好吧，現(xiàn)在請客戶來發(fā)言。

*位是華大基因研究員宋盧挺。他之前一直用REPLI-g mini kit，這一次評估了REPLI-g Single Cell Kit。他選用正常的淋巴細胞系樣品，分別做了1個無擴增的大量細胞（>1000000個）、1個Qiagen REPLI-g single cell kit單細胞、3個Qiagen REPLI-g mini kit單細胞、1個Qiagen REPLI-g mini kit多細胞（約15細胞）樣品的約0.5x全基因組測序。

他認為，相對于原REPLI-g mini kit，新的single cell kit可極大地降低擴增偏向性，實現(xiàn)全基因組較均一的擴增（接近無擴增的效果），使此試劑盒產(chǎn)物有了同時可檢測SNP和CNV、SV的可能性。但在Mean Mapping Quality、Read mapping ratio、Read duplicated ratio等數(shù)據(jù)方面，因原REPLI-g mini kit效果已較好，無變化。

第二位是新加坡基因組研究院的Masafumi Muratani 博士。他談道：“我已經(jīng)試過了這個試劑盒，并成功開展了單細胞全基因組擴增。所獲得的DNA 讓我能可靠檢測一個結(jié)腸直腸癌細胞系中等位基因特異的點突變。擴增后DNA 的出色產(chǎn)量和序列代表性確實幫助我推進了單細胞基因組學(xué)的研究工作。”

有了身邊這兩位研究人員的現(xiàn)身說法，現(xiàn)在您應(yīng)該充滿信心了吧。如果您恰好在從事癌癥研究或宏基因組學(xué)研究，那么不妨試試這個新產(chǎn)品。