（二）細胞融合
1．細胞融合前準備
（1）骨髓瘤細胞系的選擇：
骨髓瘤細胞應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜
交瘤在同一品系小鼠腹腔內產(chǎn)生大量McAb。
（2）飼養(yǎng)細胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細胞不易生長繁殖，若
加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)
細胞。在制備McAb 的過程中，許多環(huán)節(jié) 需要加飼養(yǎng)細胞，如在雜交瘤細胞篩
選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：
小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖
維細胞系3T3 經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞。飼養(yǎng)細胞的量為一般為2×104 或
105 細胞/孔。
2．細胞融合的步驟
（1）制備飼養(yǎng)細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。
與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C 小鼠，6～10 周
↓
拉頸 處死，浸泡在75%酒精內，3～5min
↓
用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
↓
用無菌注射器注入5～6ml 預冷的培養(yǎng)液（嚴禁刺破腸管）
↓
反復沖洗，吸出沖洗液
↓
沖洗液放入10ml 離心管，1200rpm/分離5～6min
↓
用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調整細胞數(shù)至
1×105/ml
↓
加入96 孔板，100μl/孔
↓
放入37℃ CO2 孵箱培養(yǎng)
（2）制備免疫脾細胞
zui后一次加強免疫3 天后小鼠拉頸處死
↓
無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次
↓
脾臟研碎，過細胞篩
↓
離心，細胞用培養(yǎng)液洗2 次
↓
計數(shù)
↓
取108 脾淋巴細胞懸液備用
（3）制備骨髓瘤細胞
取對數(shù)生長骨髓瘤細胞離心
↓
用無血清培養(yǎng)液洗2 次
↓
計數(shù)，取得×107 細胞備用
（4）融合
①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10 或1：5 的比例混合在一起，在50ml 離心
管中用無血清不*培養(yǎng)液洗1 次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈
殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略
松動。
②90s 內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖
動。37℃水浴作用90s。
③加37℃預溫的不*培養(yǎng)液以終止PEG 作用，每隔2min 分別加入1ml、
2ml、3ml、4ml、5ml 和6ml。
④離心，800rpm, 6min。
⑤充上清，用含20%小牛血清HAT 選擇培養(yǎng)液重懸。
⑥將上述細胞，加到已有飼養(yǎng)細胞層的96 孔板內，每孔加100μl。一般一
個免疫脾臟可接種4 塊96 孔板。
⑦將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測
1．HAT 選擇雜交瘤細胞
脾細胞和骨髓瘤細胞經(jīng)PEG 處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與
骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT 選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤
細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細
胞具有上述兩種酶，在HAT 選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。
在用HAT 選擇培養(yǎng)1～2 天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4 天后瘤細胞消失，
雜交細胞形成小集落，HAT 選擇培養(yǎng)液維持7～10 天后應換用HT 培養(yǎng)液，再維
持2 周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10 面
積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養(yǎng)期
間，一般每2～3 天換一半培養(yǎng)液。
2．抗體的檢測
檢測抗體的方法應根據(jù)抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，
一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細胞McAb
的檢測。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細胞和病毒等McAb
的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的McAb 的檢測。（4）其它如間
接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。
（四）雜交瘤的克隆化
雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經(jīng)過HAT 篩選后的雜
交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更
多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗
體）分泌細胞和其它無關抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆
化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體
分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗
體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆
化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，
從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。
克隆化的方法很多，zui常用的是有限稀釋法
有限稀釋法克隆
（1）克隆前1 天制備飼養(yǎng)細胞層（同細胞融合）。
（2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內輕輕吹干，計數(shù)。
（3）調整細胞為3～10 個細胞/ml。
（4）取頭天準備的飼養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細胞100μl。
孵育于37℃、5%CO2 孵箱中 。
（5）在第7 天換液，以后每2～3 天換液1 次。
（6）8～9 天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。
（7）將陽性孔的細胞移至24 孔板中擴大培養(yǎng)。
（8）每個克隆應盡快凍存。
（五）雜交瘤細胞的凍存與復蘇
1．雜交瘤細胞的凍存
細胞凍存液：50%小牛血清；40%不*培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。
凍存液預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放
入-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。
2．細胞復蘇方法 將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min
內使凍存的細胞解凍，將細胞用*培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的
飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶內，置37℃、5%CO2 孵箱中培養(yǎng)，當細胞形成集落時，檢測
抗體活性。
（六）單克隆抗體的大量生產(chǎn)
大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：
（1）體外使用旋轉培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗
體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產(chǎn)，
費用較高。
（2）體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。
①實體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml 接種于小鼠背部皮
下，每處注射0.2ml,共2～4 點。待腫瘤達到一定大小后（一般10～20 天）則
可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。
②腹水的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane （降植烷）或液體石蠟于
BALB/C 鼠，1～2 周后腹腔注射1×106 個雜交瘤細胞，接種細胞7～10 天后可產(chǎn)
生腹水。

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