清肝注射液具有清熱利濕、利膽退黃之功效［1］，在臨床上已得到廣泛應(yīng)用，其揮發(fā)性成分主要來自茵陳藥材。茵陳（Herba Artemisiae Scopariae）為傳統(tǒng)中藥［2］，臨床上被廣泛用于治療黃疸、肝炎等疾病，其揮發(fā)油具有廣譜抗菌和殺菌作用［3］。在中藥制劑的質(zhì)量控制中，注射液中有效成分的來源，即其與對應(yīng)藥材的相關(guān)性十分重要。中藥及其注射液的成分非常復(fù)雜，即使用正交投影法（OPA）［4］，子窗口因子分析法（SFA）［5］，直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法（HELP）［6，7］等二維數(shù)據(jù)分辨方法進(jìn)行解析后與標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行匹配，也不能將所有物質(zhì)定性。在組分不*清楚的情況下，本實(shí)驗(yàn)充分利用聯(lián)用色譜的色譜、質(zhì)譜信息，結(jié)合光譜相關(guān)色譜法［8］，對相同條件下所得的清肝注射液和茵陳藥材揮發(fā)性成分的數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)的對比。報(bào)道如下。

　　1  儀器與試藥

　　GC-8100型氣相色譜儀（滕州市經(jīng)緯分析儀器有限責(zé)任公司）；揮發(fā)油提取器。

　　清肝注射液（批號：040607）和茵陳藥材均由江西省天施康中藥股份有限公司提供；正己烷為分析純，水為蒸餾水。

　　2  方法

　　2.1  方法原理相同條件下所得的兩個色譜曲線，雖然同*出組分的保留時間可能存在漂移，但其光譜（或質(zhì)譜）應(yīng)該相同或相似。因此，通過對不同流出時間點(diǎn)的光譜（或質(zhì)譜）進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，可得一個類似色譜的光譜相關(guān)系數(shù)曲線，稱之為光譜相關(guān)色譜［8］。

　　一般說來，兩個組分的光譜相關(guān)系數(shù)可由下式計(jì)算：

　　r（i,j）=（si-i）T（sj-j）ll（sj-j）ll（sj-j）ll          （1）

　　式中- 1 ≤  ≤1 ， r越大表示組分i的光譜（或質(zhì)譜）si 與組分j 的光譜（或質(zhì)譜）Sj 越相似。當(dāng)r = 1 且保留時間相近時，色譜曲線中的兩個組分應(yīng)為同一化學(xué)物質(zhì)。實(shí)際上，由于噪聲和量測誤差等因素的存在， r zui大值不可能等于1，只能接近于1。‖·‖表示Frobenius 范數(shù)， T為向量的轉(zhuǎn)置，變量上的一橫表示相應(yīng)變量的均值。

　　設(shè)某一樣本化學(xué)色譜指紋圖譜的某一組分純物質(zhì)質(zhì)譜為s,另一樣本色譜指紋圖譜所包含的所有質(zhì)譜,即每一保留時間點(diǎn)所對應(yīng)的質(zhì)譜，記為xj （ j = 1 , . . . , m , m 為zui大色譜保留時間點(diǎn)） ，計(jì)算s與xj 的相關(guān)系數(shù)即可得相對于該純物質(zhì)的光譜相關(guān)色譜，根據(jù)式（1） 計(jì)算如下：

　　r（s,xj）=（s-）T（xj-j）ll（s-）ll ll（xj-j）ll        （2）

　　將r （ s , Xj） 對色譜保留時間作圖即得到該目標(biāo)物質(zhì)與這一樣本色譜指紋圖譜的光譜相關(guān)色譜曲線。如果色譜流出時間方向上所對應(yīng)的一段光譜相關(guān)色譜曲線的值很接近1，則說明目標(biāo)物質(zhì)存在于該樣本，再結(jié)合色譜保留時間信息即可實(shí)現(xiàn)相同條件下樣本的相關(guān)性分析。

　　2.2   供試品溶液的制備量取注射液50 ml（或稱取藥材12.5 g），置于圓底燒瓶中，加玻璃珠數(shù)粒，連接揮發(fā)油提取器。揮發(fā)油提取器的收集管中上端加水，使充滿刻度部分，再加正己烷1 ml，連接回流冷凝管，適當(dāng)溫控提取。從回流開始計(jì)時，控制溫度使每分鐘約20滴。60 min后停止加熱，冷卻，收集含有揮發(fā)油組分的正己烷溶液。用正己烷定容至2 ml，即得。所用藥材的量與注射液的濃度一致。

　　2.3   色譜條件

　　2.3.1  GC條件OV-1彈性石英毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm，進(jìn)樣口溫度250℃，載氣為N2，流速0.70 ml·min-1，分流比5∶1，程序升溫起始溫度為60℃ （保持5 min），然后以4℃·min-1的速度升溫至240 ℃（保持5 min），進(jìn)樣量1μl。

　　2.3.2  MS條件電離方式為EI源；電子能量0.75 kv；離子源溫度200℃；質(zhì)量范圍（m/z）30～400 amu；掃描間隔0.2 s/scan。

　　3  結(jié)果

　　3.1  茵陳藥材與注射液中揮發(fā)性成分定性、定量分析采用GC/MS聯(lián)用技術(shù)，對茵陳藥材和清肝注射液中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，分別分離出28個和23個主要成分。將所得各成分的質(zhì)譜圖，直接用該機(jī)的數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行檢索（譜庫NIST107），并用標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，確定其成分。用島津公司GC/MS工作站中的峰面積歸一化法，測定各成分的相對百分含量。定性、定量結(jié)果見表1。表1  清肝注射液和茵陳藥材中揮發(fā)性成分定性、定量結(jié)果%表1中第1列左邊數(shù)字表示在茵陳中的峰號，右邊數(shù)字表示在清肝注射液中的峰號；“-”表示未被檢出

　　3.2  茵陳藥材與清肝注射液中揮發(fā)性成分的相關(guān)性分析

　　a茵陳藥材中揮發(fā)性成分的TLC  b清肝注射液中揮發(fā)性成分的TLC

　　圖1為茵陳藥材和清肝注射液中揮發(fā)性成分的總離子流圖（TLC），它們均是很復(fù)雜的分析體系, 大部分色譜峰都達(dá)到基線分離，但也有些色譜峰出現(xiàn)重疊現(xiàn)象。對于已得到定性結(jié)果的譜峰，根據(jù)二者的色譜保留時間以及定性分析結(jié)果可以確定其相關(guān)關(guān)系及歸屬問題。對于匹配率較低的譜峰，如清肝注射液中的15號、17號和18號峰，采用光譜相關(guān)色譜的方法來確定它們的對應(yīng)關(guān)系。

　　在相關(guān)色譜分析前，首先要得到各譜峰的純質(zhì)譜。17號和18號峰均為純峰，各色譜流出點(diǎn)對應(yīng)的質(zhì)譜圖均相同。因此，任取其中的一點(diǎn)對應(yīng)的質(zhì)譜即可得到其純質(zhì)譜。由于15號峰不純，首先要確定純物質(zhì)區(qū)域，這可以通過二維數(shù)據(jù)解析［6，7］獲得。其純物質(zhì)區(qū)域各點(diǎn)對應(yīng)的質(zhì)譜為純質(zhì)譜。在實(shí)際計(jì)算中，為了避免噪聲和計(jì)算誤差的影響，我們一般選取色譜響應(yīng)值zui高的點(diǎn)附近的一段區(qū)域，進(jìn)行重復(fù)計(jì)算得到光譜相關(guān)色譜。

　　如清肝注射液中18號峰與藥材中對應(yīng)譜峰的確定。清肝注射液中18號峰的純質(zhì)譜，記為S1。根據(jù)公式（2）對茵陳藥材數(shù)據(jù)中保留時間為35.5～40 min的部分作相關(guān)色譜分析，可得注射液中18號峰與茵陳藥材圖譜的光譜相關(guān)色譜（見圖2）。在光譜相關(guān)色譜中，35.5～40 min的相關(guān)系數(shù)值zui大為0. 998 8，很接近1 ，其對應(yīng)的色譜流出時間與茵陳藥材的24號峰的一致，這說明清肝注射液中的組分18與茵陳藥材圖譜中組分24的質(zhì)譜十分相似,應(yīng)為同一物質(zhì)（見圖3～4）。用相同方法對清肝注射液中的15號和17號峰與茵陳藥材圖譜中組分的對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析，確定其分別與茵陳藥材譜圖中的21號和23號譜峰相對應(yīng)。

　　清肝注射液中的23個主要成分中除4號和21號峰外，其余均來源于茵陳藥材。4號峰和21號峰對應(yīng)的物質(zhì)可能來源于助溶劑吐溫-80，但進(jìn)一步的確認(rèn)還需要實(shí)驗(yàn)的證明。茵陳藥材中揮發(fā)性成分的zui高響應(yīng)值約為清肝注射液中物質(zhì)zui高響應(yīng)值的7倍?？梢姡瑥S家*可以改進(jìn)工藝提高藥材中揮發(fā)性成分的提取率。