蛋白專題：蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot ）

來源：上海北諾生物科技有限公司 2012年12月16日 19:21

蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot ）可以：（1）從蛋白質(zhì)混合物中檢出目標(biāo)蛋白質(zhì)；（2）定量或定性確定細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；（3）用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。

實(shí)驗(yàn)方法

底物化學(xué)發(fā)光ECL法

實(shí)驗(yàn)方法原理	Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)材料	蛋白質(zhì)樣品
試劑、試劑盒	丙烯酰胺 SDS Tris-HCl β-巰基乙醇 ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考馬斯亮蘭乙酸脫脂奶粉硫酸鎳胺 H2O2 DAB試劑盒
儀器、耗材	電泳儀電泳槽離心機(jī) 離心管硝酸纖維素膜勻漿器剪刀移液槍刮棒
實(shí)驗(yàn)步驟	一、試劑準(zhǔn)備 1. SDS-PAGE試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。 2. 勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl（pH 6.8） 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巰基乙醇 0.2 ml；ddH₂O 2.8 ml。 3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH₂O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS（pH7.4）：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na₂HPO₄1.44 g；KH₂PO₄ 0.24 g；加ddH₂O至1000 ml。 5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH₂O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml；H₂0₂ 1.0 μl。二、蛋白樣品制備 1. 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取（1）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。（2）每瓶細(xì)胞加3 ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1 min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）（4）每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）（6）于4℃下12000 rpm離心5 min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）（7）將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于－20℃保存。 2. 組織中總蛋白的提取（1）將少量組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。（2）加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。（4）裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。 3. 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?/div> （1）將培養(yǎng)液倒至15 ml離心管中，于2500 rpm離心5 min。（2）棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。（3）用槍洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。三、蛋白含量的測定 1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（1）從－20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。（2）取18個(gè)1.5 ml離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。（3）按下表在各管中加入各種試劑。（4）混勻后，室溫放置2 min。在生物分光光度計(jì)（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。 2. 檢測樣品蛋白含量（1）取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml。室溫放置30 min后即可用于測蛋白。（2）取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。（3）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用無菌水洗一次。（4）取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。注意：每測一個(gè)樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次。可同時(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量。四、SDS－PAGE電泳 1. 清洗玻璃板一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。 2. 灌膠與上樣（1）玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）（2）按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會被沖變型。）（3）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。（4）按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。（5）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）（6）測完蛋白含量后，計(jì)算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15 μl，加樣孔的zui大限度可加20 μl樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。（7）加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。 3. 電泳電泳時(shí)間一般4～5 h，電壓為40 V較好，也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。五、轉(zhuǎn)膜 1. 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜廴灸?。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。 2. 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。 3. 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。 4. 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。zui后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。） 5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h。 6. 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。六、免疫反應(yīng) 1 . 將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。 2. 將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5 ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。 3. 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。七、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影 1. 將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。 2. 在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大小（比膜的長和寬均需大1 cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上X-光片夾，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為1～2 min（20～25℃），溫度過低時(shí)（低于16℃）需適當(dāng)延長顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5～10 min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響。八、凝膠圖象分析* 將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。展開
注意事項(xiàng)	1. 一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定*條件。 2. 顯色液必須新鮮配置使用，zui后加入H₂O₂。 3. DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。實(shí)驗(yàn)方法
其他	一、免疫反應(yīng) 1. 用0.01 M PBS洗膜，5 min ×3次。 2. 加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2 h。 3. 棄包被液，用0.01 M PBS洗膜，5 min×3次。 4. 加入一抗（按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置12 h以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。 5. 棄一抗和1%BSA，用0.01 M PBS分別洗膜，5 min×4次。 6. 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋），平穩(wěn)搖動，室溫2 h。 7. 棄二抗，用0.01 M PBS洗膜，5 min×4次。 8. 加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

fangweibin119: western blot問題解答

從組織提的蛋白，分子量180kd，上樣量40ug，70v，110v電泳，300mA兩小時(shí)濕轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)，santa一抗 1：500TBST稀釋（推薦1：100-1：1000）4°C孵過夜，國產(chǎn)二抗1：2000TBST稀釋（推薦1：2000-1：5000）室溫2+小時(shí)。都是TBST洗膜3*10min。發(fā)光劑是碧云天ECL PLUS。幾乎整張膜都發(fā)光，像盞黑夜里的明燈，失敗的原因分析。

發(fā)表于2009-03-13 12:48
bacteria_virus: 有關(guān)western-blot的原理

蛋白質(zhì)變性是結(jié)構(gòu)改變，一級結(jié)構(gòu)未改變?？乖砦挥芯€性表位和構(gòu)象表位之分，不同的抗體可能識別的就不一樣。做WB的抗體識別線性表位。我覺得，做WB，與抗體反應(yīng)，這不能判斷蛋白的活性。

發(fā)表于2007-02-28 20:46
bigman2003: 我做Western-blot的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)分享

我屬于做Western-blot的新手，剛剛學(xué)習(xí)該技術(shù)不過1個(gè)多月，目前利用周末完成實(shí)驗(yàn)，平時(shí)還要上班管病人。我現(xiàn)在跑的蛋白已經(jīng)很清晰了，背靜很干凈。在開始做之前摸條件，我先是跑膠，然后考染，不轉(zhuǎn)膜，看是否有蛋白提取出來，走的條帶是否清晰，做了3次左右，然后染了兩次Actin 一抗，zui后自己的抗體到了只摸索了一次就開始正式實(shí)驗(yàn)了。在做之前也是到該論壇學(xué)習(xí)了很多知識，可以說收獲不小，為我順利開始自己的實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)?，F(xiàn)在我有了一些體會，也來這里跟大家分享一下。

發(fā)表于2010-05-11 21:44
neuronboy: 原核表達(dá)的WB結(jié)果特異性差原因分析

原核表達(dá)本身是否能做出來是靠運(yùn)氣的，應(yīng)該先用考馬斯亮藍(lán)驗(yàn)證，因?yàn)檫@個(gè)技術(shù)好做。而Western blot如果不熟練容易出問題。如果你們實(shí)驗(yàn)室Western做得不怎么樣，那么一個(gè)靠運(yùn)氣的技術(shù)用一個(gè)有問題的技術(shù)是無法驗(yàn)證的。

發(fā)表于2011-11-06 09:58
rarazhuzhu: western-blot結(jié)果出現(xiàn)混亂的黑色影子，沒見明顯條帶的原因是什么？

western-blot結(jié)果出現(xiàn)混亂的黑色影子，沒見明顯條帶的原因主要是恒壓轉(zhuǎn)膜方面、可能是block這部出了問題、1抗孵育條件和時(shí)間、2抗?jié)舛忍摺?/p>

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