正常小鼠前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)

來源：上海通派生物科技有限公司 2012年10月10日 17:19

實驗材料：

1. 細(xì)胞來源：8—12天齡的小鼠；

2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.4；

3. 消化液：0.3%膠原酶溶液，含4%牛血清白蛋白。用Hanks液配制；

4. DW培養(yǎng)液：DMEM和WAJC404培養(yǎng)液按1：1（V/V）混合，添加100IU/ml青霉素、50µg/ml鏈霉素；人類正常細(xì)胞株

5. 培養(yǎng)液a：DW培養(yǎng)液，10%胎牛血清；

6. 培養(yǎng)液b：DW培養(yǎng)液，補充胰島素10µg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白10µg/ml、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）10ng/ml和高密度脂蛋白（HDL）溶液5µl/ml；

7. 高密度脂蛋白（HDL）溶液：含蛋白質(zhì)18mg/ml和膽固醇10mg/ml；

8. 地塞米松：工作濃度為10 -7 mol/L；

9. 篩網(wǎng)：孔徑分別為250µm與80µm的尼龍網(wǎng)篩；

實驗方法：

1. 取材；

① 取8—12天齡的小鼠，窒息處死后，置于冰塊上；

② 在無菌條件下迅速切取腹股溝的脂肪墊，放入PBS液中；

③ 清除脂肪墊中的大血管和結(jié)締組織，洗凈血污。稱取脂肪墊的重量；

2. 分離細(xì)胞；

① 將脂肪墊剪成1mm 3 左右的小塊，轉(zhuǎn)入50ml錐形離心管中；

② 每0.1g組織塊加入3—4ml消化液。在37℃水浴搖床上以60r/min的轉(zhuǎn)速輕微振蕩，消化1h。其間每隔10min取出離心管，搖動，使組織塊與消化液充分混勻；

③ 消化完后，用吸管反復(fù)吹打消化液，分散組織塊，制成細(xì)胞懸液；

④ 用孔徑為250µm的尼龍網(wǎng)篩過濾細(xì)胞懸液，除去未分散的組織塊，收集濾液。將濾過液再用孔徑為80µm的尼龍網(wǎng)篩過濾，除去大部分成熟脂肪細(xì)胞，收集濾液；

⑤ 將zui后得到的濾液離心（700g，7—10min）。吸棄漂浮的脂肪細(xì)胞和消化液；

⑥ 用培養(yǎng)液a清洗細(xì)胞，離心（700g，7min）。將細(xì)胞團(tuán)制成懸液，再離心。zui后，將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液a重新制成細(xì)胞懸液。

3. 原代培養(yǎng)；

① 用培養(yǎng)液a調(diào)節(jié)細(xì)胞密度。將細(xì)胞以1.5×10 4個/cm 2 的密度接種于培養(yǎng)板中；

② 24h后，用DW培養(yǎng)液*清洗細(xì)胞，除去培養(yǎng)物中殘留的胎牛血清和未貼壁的細(xì)胞（主要為紅細(xì)胞）；

③ 換入培養(yǎng)液b，在37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后用培養(yǎng)液b維持培養(yǎng)。每3d換液一次；

④ 在細(xì)胞匯合成片后，繼續(xù)培養(yǎng)；或于細(xì)胞匯合成片后第五天，在培養(yǎng)液b中加入10 -7 mol/L地塞米松，繼續(xù)培養(yǎng)；

⑤ 培養(yǎng)至出現(xiàn)漂浮細(xì)胞時，即可收貨細(xì)胞，進(jìn)行鑒定。

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