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正常骨內(nèi)成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)
人類正常細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)材料：
1. 骨組織來源：新生或胚胎大鼠、兔、人類胚胎或手術(shù)切除之骨組織；
2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；
3. 消化液：0.25%胰蛋白酶溶液，1mg/mlⅡ型膠原酶溶液；
4. 培養(yǎng)液：RPMI 1640培養(yǎng)基，配制培養(yǎng)液時(shí)加入15%的小牛血清，并用5.6% NaHCO3 調(diào)節(jié)至pH 7.2。
人類正常細(xì)胞株
1. 取生后1—2d大鼠若干只，拉頸處死后投入盛有75%乙醇的容器內(nèi)消毒3—5min。取出置于消毒培養(yǎng)皿中；
2. 用手術(shù)剪剪開頭頂部皮膚，取顱蓋骨（扁骨），放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中。去除骨膜及周圍結(jié)締組織，再用緩沖液洗2次；
3. 將洗好的顱蓋骨片置于含少量小牛血清的培養(yǎng)皿中剪碎成1mm×1mm大小的骨片植塊；
4. 將骨片植塊直接接種于25ml螺旋口培養(yǎng)瓶內(nèi)。也可在接種前，先用1mg/mlⅡ型膠原酶溶液消化植塊15—20min，經(jīng)緩沖液清洗2次以除去消化液，加少量小牛血清于培養(yǎng)皿內(nèi)，再將侵于小牛血清中的骨片植塊接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)。為了便于細(xì)胞鑒定，可在接種時(shí)將消毒蓋玻片條置于植塊周圍；
5. 反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使種植有植塊的一面朝上。加入3ml左右的培養(yǎng)液，蓋好螺旋蓋，但不擰得過緊，以利于與外界進(jìn)行氣體交換。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2 、飽和濕度的CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
6. 2h后，植塊黏附較為牢固，此時(shí)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸沒于培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。間隔3d換液一次。
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