何選擇合適的陽性對(duì)照？ 
　　陽性對(duì)照的基本組成應(yīng)該盡量與檢測(cè)樣本的組成一致,一般陽性對(duì)照多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì),加入一定量的待檢物質(zhì).比如,以人血清為標(biāo)本的測(cè)定,陽性對(duì)照多用確定的病人血清或者以復(fù)鈣人血漿為原料加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品.

如何選擇合適的陰性對(duì)照？ 
　　陰性對(duì)照的基本組成也應(yīng)該盡量與檢測(cè)樣本的組成一致,先行檢測(cè)確定其中不含待檢物質(zhì).比如,檢測(cè)人血清標(biāo)本時(shí),陰性對(duì)照應(yīng)該選擇正常人血清;檢測(cè)免疫動(dòng)物血清中抗體效價(jià)時(shí),陰性對(duì)照應(yīng)該選擇該動(dòng)物的免疫前血清.

如何選擇*化的包被條件？ 
1.包被抗原的選擇
    包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類.天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被,對(duì)于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被（先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上,再通過特異性反應(yīng)使抗原固相化）.經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板.小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機(jī)化合物,由于分子量太小,往往難于直接吸附在酶標(biāo)板上,一般都先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián),偶聯(lián)物吸附于固相載體上. 
2.包被液的選擇
    一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液,如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話,也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液.
3.包被溫度的選擇
    通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時(shí),我們強(qiáng)烈建議4-8度條件下包被,有利于蛋白活性的保持. 
4.包被濃度的選擇
    包被的zui適濃度隨固相載體和包被物的性質(zhì)變化,一般蛋白質(zhì)的包被濃度為1-5ug/ml,要明確針對(duì)特定包被抗原的zui適包被濃度需要通過實(shí)驗(yàn)來確定. 
包板后需要封閉嗎？應(yīng)該選擇什么樣的封閉體系？ 
    封閉是否必要,取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件.一般說來,雙抗體夾心法,只要酶標(biāo)記物是高活性的,操作時(shí)洗滌*,不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果.而在間接法測(cè)定中,封閉一般是*的.
    常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉,推薦使用5%脫脂奶粉,價(jià)廉而且封閉能力強(qiáng),不過5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用,不宜長(zhǎng)期保存,所以試劑盒中較少使用. 

如何正確使用酶結(jié)合物？
1.酶結(jié)合物的稀釋液
    在稀釋液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%BSA或5%脫脂奶粉）,通過競(jìng)爭(zhēng)抑制酶結(jié)合物在固相載體上的非特異性吸附.一般還加入能夠抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑,如吐溫20（0.05%的濃度較為適宜）.
2.正確稀釋酶結(jié)合物 
    酶結(jié)合物的合適工作濃度需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定,濃度過高易導(dǎo)致本底偏高,濃度過低則會(huì)導(dǎo)致陽性信號(hào)的減弱.
    酶結(jié)合物在使用前稀釋,稀釋后的酶結(jié)合物不宜長(zhǎng)期保存,因?yàn)榈蜐舛鹊拿附Y(jié)合物極易失活.

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