賽默飛熒光定量PCR儀的工作原理

賽默飛熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific Real-Time PCR Systems）是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術(shù)的熒光定量檢測設(shè)備，其核心原理是通過實時監(jiān)測熒光信號的變化來定量分析核酸擴增過程，揭示目標(biāo)DNA或RNA的起始量。以下是賽默飛熒光定量PCR儀的詳細(xì)工作原理：

1. 基本工作流程

賽默飛熒光定量PCR儀的工作流程可以分為以下幾個階段：

(1) 樣本準(zhǔn)備

• 提取核酸：目標(biāo)DNA或RNA從細(xì)胞、組織或其他樣本中提取。

• 反轉(zhuǎn)錄（對于RNA樣本）：使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。

(2) PCR反應(yīng)設(shè)置

• 反應(yīng)體系：PCR混合液包括模板核酸、引物、探針或熒光染料、dNTP、Taq DNA聚合酶及緩沖液。

• PCR試劑：

• 使用特定熒光標(biāo)記的探針（如TaqMan探針）或熒光染料（如SYBR Green）以實時監(jiān)測擴增反應(yīng)。

(3) PCR循環(huán)

PCR反應(yīng)在熱循環(huán)系統(tǒng)中分為以下三個步驟，循環(huán)30-40次：

1. 變性：高溫（通常為95℃）使雙鏈DNA分離為單鏈。

2. 退火：降低溫度（通常為55-65℃），引物與模板DNA結(jié)合。

3. 延伸：通過Taq DNA聚合酶在72℃合成新鏈。

(4) 熒光信號檢測

• 賽默飛熒光定量PCR儀內(nèi)置的光學(xué)檢測系統(tǒng)實時監(jiān)測每個PCR循環(huán)中的熒光信號變化。

• 熒光強度與目標(biāo)核酸的擴增量成正比。

2. 熒光定量PCR的關(guān)鍵技術(shù)

(1) 熒光信號產(chǎn)生與檢測

賽默飛熒光定量PCR儀使用熒光探針或染料標(biāo)記擴增反應(yīng)的產(chǎn)物，具體技術(shù)包括：

1. TaqMan探針法

• 探針是一段帶有熒光標(biāo)記和猝滅基團的寡核苷酸。

• 工作原理：

• 在PCR延伸階段，Taq DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性將探針降解，釋放熒光基團，使熒光信號得以監(jiān)測。

• 熒光強度與擴增產(chǎn)物數(shù)量呈線性相關(guān)。

2. SYBR Green染料法

• SYBR Green是一種嵌入雙鏈DNA的熒光染料。

• 工作原理：

• 隨著PCR反應(yīng)中雙鏈DNA的生成，SYBR Green嵌入其中，產(chǎn)生熒光信號。

• 熒光強度的增加反映擴增產(chǎn)物的累積量。

3. 高分辨率熔解曲線分析（HRM）

• HRM技術(shù)通過監(jiān)測DNA解鏈時的熒光信號變化，用于檢測單核苷酸多態(tài)性（SNP）和突變分析。

(2) 定量方法

賽默飛熒光定量PCR儀通過以下兩種方式實現(xiàn)核酸的絕對定量或相對定量分析：

1. 絕對定量

• 使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號，計算未知樣本中核酸的起始量。

2. 相對定量

• 通過參考基因的表達(dá)量對目標(biāo)基因進行標(biāo)準(zhǔn)化分析，適合基因表達(dá)研究。

(3) 光學(xué)檢測系統(tǒng)

• 賽默飛熒光定量PCR儀配備多色光學(xué)檢測系統(tǒng)：

• 使用LED光源激發(fā)熒光。

• CCD相機或光電二極管陣列捕獲熒光信號。

• 系統(tǒng)實時采集熒光信號并進行數(shù)據(jù)分析。

3. 數(shù)據(jù)分析與結(jié)果輸出

賽默飛熒光定量PCR儀通過內(nèi)置的軟件平臺對熒光信號進行分析，主要步驟包括：

(1) 閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）

• Ct值是熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時的PCR循環(huán)數(shù)。

• Ct值越低，模板起始量越高。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

• 通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算未知樣本的絕對濃度。

(3) 熔解曲線

• 熔解曲線用于驗證PCR擴增的特異性，單一峰值表明反應(yīng)特異性好，多峰值可能提示非特異擴增或引物二聚體。

(4) 定量結(jié)果展示

• 數(shù)據(jù)可通過曲線圖、柱狀圖等形式直觀展示，便于分析。

4. 賽默飛熒光定量PCR儀的優(yōu)化設(shè)計

1. 高靈敏光學(xué)檢測

• 多通道熒光檢測系統(tǒng)可同時監(jiān)測多個靶標(biāo)，確保實驗靈活性和高效性。

2. 快速熱循環(huán)系統(tǒng)

• 賽默飛儀器通過精準(zhǔn)的溫度控制系統(tǒng)，加速PCR反應(yīng)，縮短實驗時間。

3. 智能化軟件平臺

• 支持自動分析Ct值、熔解曲線，簡化數(shù)據(jù)處理流程。

• 云端連接功能，支持遠(yuǎn)程實驗管理和數(shù)據(jù)共享。

4. 兼容性與靈活性

• 支持96孔、384孔板和TaqMan Array卡等多種平臺。

• 靈活適配不同熒光染料和探針。

5. 賽默飛熒光定量PCR儀的優(yōu)勢

• 靈敏度高：精確檢測低豐度模板。

• 多通道檢測：最多支持8色熒光檢測，適合多重實驗。

• 實驗效率高：快速模式大幅縮短反應(yīng)時間。

• 特異性強：采用TaqMan探針，避免非特異性擴增影響結(jié)果。

• 便捷操作：直觀界面設(shè)計，支持自動化運行。

6. 應(yīng)用領(lǐng)域

1. 基因表達(dá)分析

• 精確定量基因表達(dá)變化，用于研究基因調(diào)控機制。

2. 病原體檢測

• 快速、準(zhǔn)確檢測病毒和細(xì)菌，核酸檢測。

3. 遺傳突變分析

• 檢測SNP和點突變，適合癌癥研究和遺傳性疾病篩查。

4. 藥物篩選

• 高通量基因表達(dá)分析，為新藥開發(fā)提供支持。

5. 分子診斷

• 應(yīng)用于個性化醫(yī)療，通過實時檢測提供臨床診斷依據(jù)。

總結(jié)

賽默飛熒光定量PCR儀通過先進的光學(xué)檢測系統(tǒng)、靈敏的熒光探針技術(shù)和高效的反應(yīng)體系，確保實驗數(shù)據(jù)的精確性與可靠性。其工作原理結(jié)合TaqMan探針法和SYBR Green染料法，支持多種定量檢測需求。同時，智能化操作和多樣化適配平臺使其廣泛應(yīng)用于科研和臨床領(lǐng)域，為分子生物學(xué)研究提供強有力的技術(shù)支持。