摘要：本研究聚焦于電穿孔轉(zhuǎn)染法中電場強度這一關鍵參數(shù)，通過一系列實驗對其進行優(yōu)化以提高基因表達效率。詳細闡述了電穿孔轉(zhuǎn)染的原理、不同電場強度對細胞生理狀態(tài)和基因轉(zhuǎn)染效率的影響，并對實驗結(jié)果進行深入分析。研究結(jié)果為電穿孔轉(zhuǎn)染技術在基因治療、細胞生物學研究等領域的更高效應用提供了重要參考，有助于推動相關領域向更精準、更有效的方向發(fā)展。

一、引言

在現(xiàn)代生物技術領域，基因轉(zhuǎn)染技術是將外源基因?qū)爰毎年P鍵手段，對于基因功能研究、基因治療等眾多方面具有至關重要的意義。電穿孔轉(zhuǎn)染法作為一種廣泛應用的物理轉(zhuǎn)染方法，利用短暫的高電場脈沖在細胞膜上形成可逆性的微孔，從而使外源 DNA 能夠進入細胞。然而，電場強度作為電穿孔轉(zhuǎn)染過程中的關鍵參數(shù)，直接影響轉(zhuǎn)染效率和細胞的存活狀態(tài)。過高的電場強度可能導致細胞不可逆損傷，而過低則無法有效形成足夠的膜孔使外源基因進入細胞，進而影響基因表達效率。因此，對電穿孔轉(zhuǎn)染法電場強度的優(yōu)化研究迫在眉睫，這將為提高基因轉(zhuǎn)染的成功率和基因表達水平提供有力支持，為生命科學研究開辟更廣闊的前景。

二、材料與方法

（一）細胞系與試劑

細胞系
選取常用的哺乳動物細胞系，如 HeLa 細胞（人宮頸癌細胞系）、CHO 細胞（中國倉鼠卵巢細胞系）作為研究對象。這些細胞系具有生長特性明確、易于培養(yǎng)等優(yōu)點，廣泛應用于轉(zhuǎn)染實驗研究。

試劑

培養(yǎng)基：根據(jù)細胞類型選擇合適的培養(yǎng)基，如 HeLa 細胞使用 DMEM 高糖培養(yǎng)基，CHO 細胞使用 Ham's F - 12 培養(yǎng)基，均添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素混合液。

外源 DNA：選用帶有報告基因（如綠色熒光蛋白基因 GFP）的質(zhì)粒 DNA，通過標準的分子生物學技術進行提取和純化，確保 DNA 的純度和完整性。

電穿孔緩沖液：使用專門配制的電穿孔緩沖液，其成分經(jīng)過優(yōu)化，能夠在電穿孔過程中維持細胞的生理狀態(tài)，減少對細胞的損傷。

（二）電穿孔設備

采用先進的電穿孔儀，該儀器能夠精確控制電場強度、脈沖時間和脈沖次數(shù)等參數(shù)。電穿孔儀配備不同類型的電穿孔 cuvette（小室），其電極間距和容積根據(jù)實驗需求進行選擇，以適應不同細胞濃度和體積的轉(zhuǎn)染實驗。

（三）實驗設計

細胞準備
將處于對數(shù)生長期的細胞用胰蛋白酶消化后，離心收集細胞，用預冷的電穿孔緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至合適范圍（如 HeLa 細胞為 1×10? - 5×10?個 /mL，CHO 細胞為 2×10? - 6×10?個 /mL）。

電穿孔轉(zhuǎn)染

將細胞懸液與等體積的含有外源 DNA 的溶液混合，加入到電穿孔 cuvette 中。設置不同的電場強度梯度，范圍從 50V/cm 到 2000V/cm，每次增加 100 - 200V/cm。脈沖時間固定為若干微秒（如 50μs），脈沖次數(shù)設定為 1 - 3 次。

在每個電場強度條件下，進行多次重復實驗（如 n = 3 - 5），以確保數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。

轉(zhuǎn)染后處理
電穿孔轉(zhuǎn)染完成后，迅速將細胞轉(zhuǎn)移至含有完整培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后 24、48、72 小時等不同時間點進行后續(xù)檢測。

（四）檢測方法

細胞活力檢測
采用臺盼藍拒染法結(jié)合細胞計數(shù)儀來評估細胞活力。在轉(zhuǎn)染后特定時間點，取一定量的細胞懸液與臺盼藍溶液混合，然后在細胞計數(shù)儀上進行計數(shù)。活細胞能夠排斥臺盼藍，而死細胞則被染成藍色，通過計算活細胞的比例來確定細胞活力。

基因表達效率檢測

熒光顯微鏡觀察：對于轉(zhuǎn)染帶有 GFP 基因的細胞，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況。通過隨機選取多個視野，統(tǒng)計發(fā)出綠色熒光的細胞數(shù)量，計算轉(zhuǎn)染陽性細胞的比例，以此初步評估基因轉(zhuǎn)染效率。

流式 cytometry（流式細胞術）分析：將細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，通過流式細胞儀對 GFP 陽性細胞進行定量分析。流式細胞儀能夠精確地檢測每個細胞的熒光強度，根據(jù)熒光強度的閾值設定，可以準確計算出轉(zhuǎn)染陽性細胞的百分比和平均熒光強度，更準確地反映基因表達效率。

定量 PCR（qPCR）檢測：提取細胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，然后使用特異性引物對目的基因（GFP 或其他相關基因）進行定量 PCR 分析。通過與內(nèi)參基因（如 GAPDH）的比較，計算目的基因的相對表達量，從轉(zhuǎn)錄水平進一步驗證基因表達效率。

Western blotting 檢測：提取細胞總蛋白，進行 SDS - PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，用特異性抗體（如抗 - GFP 抗體）進行免疫印跡檢測。通過檢測目的蛋白的表達水平，從翻譯水平確定基因表達情況，并結(jié)合蛋白條帶的灰度分析進行定量比較。

三、結(jié)果

（一）細胞活力與電場強度的關系

隨著電場強度的增加，細胞活力呈現(xiàn)出先相對穩(wěn)定后逐漸下降的趨勢。在較低電場強度范圍（50 - 800V/cm）內(nèi)，細胞活力保持在較高水平（約 80% - 95%），表明在此電場強度下，細胞受到的損傷較小。然而，當電場強度超過 1000V/cm 時，細胞活力開始明顯下降，在 2000V/cm 時，細胞活力可能降低至 30% - 50% 左右，說明過高的電場強度對細胞造成了嚴重的不可逆損傷。

（二）基因轉(zhuǎn)染效率與電場強度的關系

熒光顯微鏡觀察結(jié)果
在較低電場強度下（50 - 600V/cm），轉(zhuǎn)染陽性細胞數(shù)量較少，僅在視野中觀察到零星的綠色熒光細胞。隨著電場強度的升高，轉(zhuǎn)染陽性細胞比例逐漸增加，在 800 - 1200V/cm 范圍內(nèi)達到一個峰值，此時視野中綠色熒光細胞數(shù)量明顯增多。但當電場強度進一步升高超過 1500V/cm 時，轉(zhuǎn)染陽性細胞比例反而有所下降，同時部分細胞出現(xiàn)過度損傷的形態(tài)特征，如細胞膜破裂、細胞皺縮等。

流式 cytometry 分析結(jié)果
流式細胞術定量分析結(jié)果與熒光顯微鏡觀察結(jié)果趨勢一致。在 800 - 1200V/cm 電場強度區(qū)間，轉(zhuǎn)染陽性細胞百分比和平均熒光強度均達到較高值，表明基因轉(zhuǎn)染效率在此區(qū)間最高。與低電場強度（50 - 600V/cm）相比，轉(zhuǎn)染陽性細胞百分比可從不足 10% 提高到 40% - 60% 左右，平均熒光強度也有顯著增強。而在高電場強度（> 1500V/cm）下，轉(zhuǎn)染陽性細胞百分比和平均熒光強度均出現(xiàn)下降趨勢。

定量 PCR 和 Western blotting 檢測結(jié)果
qPCR 檢測顯示，在 800 - 1200V/cm 電場強度下，目的基因（GFP）的相對轉(zhuǎn)錄水平最高，與轉(zhuǎn)染陽性細胞比例的變化趨勢相符。Western blotting 結(jié)果也表明，在此電場強度區(qū)間內(nèi)，目的蛋白（GFP）的表達量在翻譯水平上達到峰值，蛋白條帶的灰度值較好，進一步證實了基因表達效率在該電場強度范圍內(nèi)優(yōu)異。

四、討論

（一）電場強度對細胞生理的影響機制

在電穿孔過程中，電場強度直接作用于細胞膜，引起細胞膜脂質(zhì)雙分子層的重排和局部破壞。在較低電場強度下，形成的膜孔較小且數(shù)量有限，能夠在脈沖結(jié)束后迅速閉合，對細胞的生理功能影響較小，這使得細胞在轉(zhuǎn)染后仍能保持較高的活力。然而，隨著電場強度的增加，膜孔的大小和數(shù)量增多，細胞膜的通透性過度增加，導致細胞內(nèi)的離子平衡、代謝物質(zhì)等發(fā)生紊亂，同時可能引起細胞膜結(jié)構的不可逆破壞，進而使細胞活力下降。

（二）電場強度對基因轉(zhuǎn)染效率的影響機制

當電場強度處于合適范圍時，足夠數(shù)量和大小的膜孔能夠允許外源 DNA 順利進入細胞。在 800 - 1200V/cm 這個優(yōu)化的電場強度區(qū)間內(nèi)，細胞膜形成了有利于外源 DNA 進入的適度孔隙結(jié)構，同時細胞的生理狀態(tài)在轉(zhuǎn)染后仍能維持較好，使得進入細胞的外源 DNA 能夠有效地進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而提高基因表達效率。而在過高或過低的電場強度下，要么膜孔形成不足無法有效攝取外源 DNA，要么細胞受到嚴重損傷無法正常進行基因表達，導致轉(zhuǎn)染效率降低。

（三）不同檢測方法的互補性

本研究采用了多種檢測方法來評估細胞活力和基因轉(zhuǎn)染效率，這些方法相互補充。熒光顯微鏡觀察能夠直觀地顯示轉(zhuǎn)染陽性細胞的分布情況，但對于轉(zhuǎn)染效率的定量分析不夠精確。流式 cytometry 則可以準確地定量轉(zhuǎn)染陽性細胞的比例和平均熒光強度，從單個細胞水平更精細地評估基因轉(zhuǎn)染情況。定量 PCR 和 Western blotting 分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進一步驗證基因表達效率，為轉(zhuǎn)染效果的全面評價提供了多維度的數(shù)據(jù)支持。

五、結(jié)論

通過對電穿孔轉(zhuǎn)染法中電場強度這一關鍵參數(shù)的系統(tǒng)研究，我們發(fā)現(xiàn)對于 HeLa 細胞和 CHO 細胞，在 800 - 1200V/cm 的電場強度范圍內(nèi)，能夠在保證細胞活力的同時實現(xiàn)較高的基因轉(zhuǎn)染效率和基因表達水平。本研究結(jié)果為電穿孔轉(zhuǎn)染技術在基因治療、細胞生物學研究等領域的應用提供了重要的實驗依據(jù)和參數(shù)優(yōu)化指導，有助于進一步提高電穿孔轉(zhuǎn)染技術的效果，推動相關領域的研究進展。未來的研究可以在此基礎上，進一步探索其他影響電穿孔轉(zhuǎn)染的因素，如脈沖時間、脈沖次數(shù)、細胞類型特異性等，以實現(xiàn)更精準、更高效的基因轉(zhuǎn)染。