CACNA2D1 regulates the progression and influences the microenvironment of colon cancer

Keywords: CACNA2D1; Colon cancer; Fibroblast; Voltage-gated calcium channel; p53.

近年來，由于化療的進步和分子靶向藥物的出現，結腸癌（CC）的治療結果有所改善。離子轉運體（Ion transporters）在細胞功能中起著至關重要的作用，近年來作為癌癥的潛在治療靶點而受到關注。闡明基因和蛋白質在癌癥微環(huán)境中的功能是引起廣泛關注的研究領域，因此，腫瘤與基質之間的關系以及腫瘤細胞與成纖維細胞之間的相互作用在癌癥調控中的重要作用值得深入探討。

電壓門控鈣離子通道（Voltage-gated Calcium Channels，VGCCs）是由 4-5 個亞基組成的復合蛋白。電壓門控性鈣通道α2/δ亞基-1（CACNA2D1）編碼 alpha2/delta 亞基家族的成員，是電壓依賴性鈣通道復合體中的一種蛋白質，已被報道為幾種癌癥的致癌基因。然而，其在 CC 中的功能尚不清楚，且與癌癥微環(huán)境之間的關系也尚未見報道。

鑒于此，日本京都府立醫(yī)科大學消化外科的課題組在最近的研究中探討了鈣通道對癌癥的作用，闡釋了 CACNA2D1 在調控 CC 患者腫瘤進展中的作用及其臨床病理意義，還討論了 CACNA2D1 表達與基質之間的關系及其對癌癥微環(huán)境的影響。研究表明，CACNA2D1 在腫瘤進展中起著至關重要的作用，并影響結腸癌患者的微環(huán)境。研究成果發(fā)表在 Journal of Gastroenterology 期刊題為“CACNA2D1 regulates the progression and influences the microenvironment of colon cancer”。

IHC 分析顯示，癌變區(qū)域的染色強度根據CACNA2D1表達水平而變化。CACNA2D1 高表達與高度分化程度的腫瘤相關。高CACNA2D1表達組的 5 年無復發(fā)生存率和5 年總生存率（OS）顯著低于CACNA2D1低表達組，證實了CACNA2D1高表達組的 CC 患者預后較差。

利用 RT-PCR 和 Western Blotting 分別檢測8 株 CC 細胞系中 CACNA2D1 的基因和蛋白表達。結果表明，每個 CC 細胞系均表達 CACNA2D1，并選擇CACNA2D1高表達的HCT116、RKO和SW480細胞進行隨后實驗。

轉染CACNA2D1 siRNA后48或72 h，HCT116、RKO和SW480細胞的數量顯著低于轉染對照siRNA的細胞（圖1 a）。增殖測定結果顯示，CACNA2D1 缺失的 HCT116、RKO 和 SW480 細胞的吸光度顯著低于對照細胞（圖1 b）。細胞周期分析顯示，與對照細胞相比，CACNA2D1 缺失的 HCT116 和 RKO 細胞中處于 sub-G1 期的細胞數量增加（圖1 c）。這些結果表明，CACNA2D1 調節(jié) CC 細胞的增殖和細胞周期。

siRNA 轉染后 72 h，CACNA2D1缺失的 HCT116、RKO 和 SW480 細胞中早期（膜聯蛋白V-陽性和 PI-陰性）和晚期凋亡細胞（膜聯蛋白V-陽性和 PI-陽性）的比例顯著高于用對照細胞（圖1 d）。這表明，CACNA2D1 會調控 CC 細胞的凋亡。傷口愈合試驗分析顯示，與對照細胞相比，CACNA2D1 缺失的 HCT116 和 RKO 細胞的遷移受到顯著抑制（圖1 e），這說明，CACNA2D1 也調控 CC 細胞的遷移。

此外，還分析了 CACNA2D1 特異性抑制劑氨氯地平（amlodipine）對 HCT116 和 RKO 細胞的抑制和細胞毒性作用，結果在兩種細胞系中均觀察到細胞毒性，且氨氯地平處理的 HCT116 和 RKO 細胞的早期和晚期細胞凋亡增加。

圖1    CACNA2D1調節(jié)結腸癌（CC）細胞的增殖、細胞周期、凋亡和遷移。

接下來，進行了共培養(yǎng)實驗（圖2 a）分析 CACNA2D1 對 CC 細胞系中成纖維細胞遷移的影響。結果發(fā)現，與陰性對照 HCT116 和 RKO 細胞相比，CACNA2D1缺失的 HCT116 和 RKO 細胞的成纖維細胞遷移受到顯著抑制（圖2 c）。這提示，CC 中的 CACNA2D1 可能調控成纖維細胞遷移并影響微環(huán)境。

敲低CACNA2D1后發(fā)現，與陰性對照 HCT116 細胞培養(yǎng)基中釋放的轉化生子因子（TGFB1）和血小板源性生長因子（PDGF-BB）相比，CACNA2D1缺失的 HCT116 培養(yǎng)基的釋放水平降低（圖2 d）。這說明，CACNA2D1調控 CC 細胞分泌的 TGFB1 和 PDGF-BB水平。

進一步利用共培養(yǎng)系統(tǒng)（圖2 b）研究 CACNA2D1 敲低是否會改變 CC 細胞系中的成纖維細胞增殖，發(fā)現 CACNA2D1 敲低并不影響 CC 細胞中的成纖維細胞增殖。

當 CC 細胞系與成纖維細胞共培養(yǎng)時，成纖維細胞轉化為癌癥相關成纖維細胞（CAF），CAF 標志物水平升高。然而，HCT116 和 RKO 細胞中的 CACNA2D1 敲低在共培養(yǎng)時可下調其標志物的表達，抑制了成纖維細胞向 CAF 的轉化（圖2 e）。

圖2    CACNA2D1對成纖維細胞與癌細胞共培養(yǎng)的影響。

最后，利用微陣列分析闡明 CACNA2D1 缺失的 HCT116 細胞的基因表達譜。結果顯示，2847 個基因上調，2832 個基因下調。生信分析IPA數據庫將“cancer”和“organismal injury and abnormalities”確定為排名靠前的兩種疾病，而排名靠前的兩種分子和細胞功能是“cellular assembly and organization”和“cellular function and maintenance”。

IPA 確定 p53 信號通路是受 CACNA2D1 敲低影響的排名靠前的經典通路之一。此外，實驗還驗證了四個已知基因（TP53、FAS、caspase 6 和 BAX，圖3 a）的表達水平。在CACNA2D1缺失的 HCT116 和 RKO 細胞中TP53、FAS、caspase 6 和 BAX 的 mRNA 表達顯著高于陰性對照細胞（圖3 c）。相反，與 EMT 相關通路相關的基因的表達下降（圖3 b）。在CACNA2D1缺失的 HCT116 和 RKO 細胞中CDH1 的 mRNA 表達顯著上調，而 CDH2、ZEB1、ZEB2、TGFB1、TGFBR1 和 VIM 的 mRNA 表達顯著下調（圖3 d）。此外，cBioPortal 數據庫也揭示了CACNA2D1 與這些基因之間的密切相關性。這些數據表明，CACNA2D1調控 p53 信號通路和上皮-間充質轉化（EMT）相關通路。

圖3    網絡分析使用微陣列分析和IPA通路分析。紅色表示基因上調，綠色表示基因下調，橙色表示預期會上調的基因，藍色表示預期會下調的基因。

綜上所述，該研究顯示，CACNA2D1 高表達水平與 CC 患者預后不良相關，并且基質表達水平也高。CACNA2D1 還可調控 CC 細胞的增殖、凋亡和遷移。此外，CACNA2D1 影響成纖維細胞的遷移并促進成纖維細胞向 CAFs 的轉化。微陣列分析顯示，CACNA2D1 改變了細胞凋亡相關和 EMT 相關基因的表達。目前的結果揭示了 CACNA2D1 在 CC 中的功能，表明其有潛力作為CC腫瘤生長的生物標志物和有希望的CC治療靶點。

參考文獻：Inoue H, Shiozaki A, Kosuga T, Shimizu H, Kudou M, Arita T, Konishi H, Komatsu S, Kuriu Y, Kubota T, Fujiwara H, Morinaga Y, Konishi E, Otsuji E. CACNA2D1 regulates the progression and influences the microenvironment of colon cancer. J Gastroenterol. 2024 Jul;59(7):556-571. doi: 10.1007/s00535-024-02095-x. Epub 2024 Mar 27. PMID: 38536483.

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