安布羅斯和魯夫昆的工作證明了microRNA在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用，這是一種全新的基因調(diào)控機(jī)制。在此之前，科學(xué)界的焦點(diǎn)主要集中在轉(zhuǎn)錄因子如何作用于DNA，從而決定哪些mRNA被合成，進(jìn)而控制遺傳信息的傳遞。然而，這兩位科學(xué)家的發(fā)現(xiàn)刷新了我們對(duì)基因調(diào)控的理解，揭示了microRNA在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中的重要性。研究顯示，人類基因組中編碼了超過1000個(gè)的microRNA，這些microRNA在生物界中普遍存在，并在維持基因平衡和細(xì)胞功能方面發(fā)揮著重要的作用。

microRNA是一類長(zhǎng)度約為 22 個(gè)核苷酸的小型 RNA，大多數(shù) miRNA 來自非編碼 RNA 或內(nèi)含子，很少有與編碼基因外顯子重疊，保守的 miRNA (即在脊椎動(dòng)物中共享) 主要通過經(jīng)典的 miRNA 途徑生成，該途徑涉及兩個(gè) RNase III 酶：Drosha 和 Dicer。

除了經(jīng)典的 Drosha/Dicer 途徑，還存在一些非經(jīng)典的 miRNA 途徑，這些途徑不依賴于 Drosha 或 Dicer。例如：

圖.miRNA合成示意圖[1]

microRNA研究涉及多個(gè)層面，從發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證新的microRNA分子，到理解它們的功能和機(jī)制，再到可能的治療應(yīng)用。以下是一些microRNA研究中的常見問題和相應(yīng)的解決方案：

目前定量分析miRNA的方法中最為常用的是熒光定量PCR。但是miRNA本身相對(duì)較小，傳統(tǒng)的RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和定量方法難以高效的保證miRNA的檢測(cè)，選對(duì)適配的方法此時(shí)則顯得尤為重要。

傳統(tǒng)的有機(jī)提取通常提取的是較大分子量的RNA，例如mRNA和核糖體RNA，但對(duì)于miRNA的提取效果則不太理想，可能是由于小分子量的miRNA不易被醇類沉淀。針對(duì)這個(gè)問題，翌圣匠心研發(fā)了專門針對(duì)miRNA提取的產(chǎn)品-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 細(xì)胞/組織miRNA提取試劑盒。

采用MolPure® RNA Column M1和microRNA Column M1以及新型的溶液體系，適用于從多種新鮮或凍存的動(dòng)物組織或培養(yǎng)細(xì)胞中快速提取各種小RNA。試劑盒內(nèi)的MolPure® RNA Column M1可選擇性吸附核酸，不吸附蛋白質(zhì)、多糖和其它非核酸類物質(zhì)；microRNA Column M1則能從總RNA中有效富集到15-30 nt左右的小RNA（包括siRNA和miRNA）。

成熟的miRNA的長(zhǎng)度只有20nt左右，通常正向引物就會(huì)覆蓋其全長(zhǎng)甚至?xí)卸嘤嗖糠?，反向引物就無處安置了。目前市面上解決方案就是在反轉(zhuǎn)錄時(shí)設(shè)法增加反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度。常見的方法有加尾法和莖環(huán)法。

加尾法利用PolyA 聚合酶為成熟的miRNA加上Poly(A)尾，以帶有通用序列的Oligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄引物，合成加長(zhǎng)的miRNA對(duì)應(yīng)cDNA第一鏈。莖環(huán)法以折疊為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的通用序列作為引物合成加長(zhǎng)的miRNA對(duì)應(yīng)cDNA第一鏈，后續(xù)擴(kuò)增過程中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)在適宜的溫度下會(huì)被打開，和相關(guān)擴(kuò)增引物結(jié)合。

圖. 加尾法合成miRNA

圖.莖環(huán)法合成miRNA

11148ES-Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

試劑盒采用加尾法來進(jìn)行miRNA第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的所有原料和引物，并經(jīng)過精心優(yōu)化，可保證miRNA 3‘末端的Poly(A)修飾過程和反轉(zhuǎn)錄過程同時(shí)高效進(jìn)行。

11171ES -Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

專門為miRNA定量檢測(cè)而研發(fā)的新一代預(yù)混形式的熒光定量PCR檢測(cè)試劑，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調(diào)整ROX的濃度，只需在配制反應(yīng)體系時(shí)加入引物和模板即可進(jìn)行擴(kuò)增。DNA 聚合酶采用化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)聚合酶，配合特殊的Buffer體系，使反應(yīng)特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

圖. 人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。每個(gè)Let-7亞型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以不用的引物，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別擴(kuò)增這些miRNA，利用公式2-ΔCT x 100%計(jì)算匹配率。結(jié)果顯示，可有效區(qū)分密切相關(guān)的亞型家族成員。

圖. 以人293T細(xì)胞和鼠源肝臟Total RNA為模板，擴(kuò)增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。結(jié)果顯示，與同類產(chǎn)品相比，Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反應(yīng)體系，具有優(yōu)異的表現(xiàn)。

11139ES-Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

該試劑盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而開發(fā)。該酶cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達(dá)60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的反轉(zhuǎn)錄。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全長(zhǎng)cDNA的能力也有了提升，可合成長(zhǎng)達(dá)19.8 kb的cDNA。

11170ES-Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

本產(chǎn)品是使用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行miRNA定量反應(yīng)的專用預(yù)混液。由于miRNA序列短，且同一家族的miRNA序列往往高度相近，故在定量時(shí)對(duì)特異性要求高。本品基于熱啟動(dòng)的 DNA 聚合酶，配以優(yōu)化的Buffer，能夠極大地減少非特異性擴(kuò)增；同時(shí)，特殊的ROX Reference Dye，使得預(yù)混液適應(yīng)于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調(diào)整ROX濃度，只需在配制反應(yīng)體系時(shí)加入引物和模板即可進(jìn)行擴(kuò)增。

圖.以小鼠肝臟細(xì)胞的Total RNA為模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋40倍后，用Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別擴(kuò)增人源的mmu-miR-125a基因。

圖.以小鼠肝臟細(xì)胞的Total RNA為模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA 以10倍梯度稀釋（范圍10pg /μL-0.1μg /μL），擴(kuò)增鼠源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。

圖. 人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。以不同的引物，使用 Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別擴(kuò)增這些miRNA，利用公式2^-△ct x 100%計(jì)算匹配率。

圖.以人293T細(xì)胞的Total RNA為模板反轉(zhuǎn)錄，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA稀釋50倍，使用Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）進(jìn)行90孔平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增人源的hsa-let-7a基因。

[1] Shang R, Lee S, Senavirathne G, Lai EC. microRNAs in action: biogenesis, function and regulation. Nat Rev Genet. 2023;24(12):816-833. doi:10.1038/s41576-023-00611-y