Shear stress associated with cardiopulmonary bypass induces expression of inflammatory cytokines and necroptosis in monocytes

Keywords: Calcium signaling; Cardiology; Cytokines; Inflammation; Surgery.

先天性心臟病是最常見(jiàn)的出生缺陷，在大多數(shù)心臟手術(shù)中，患者接受體外循環(huán)（CPB），以盡量減少心臟手術(shù)時(shí)的缺血性損傷。不良的術(shù)后結(jié)局與 CPB 手術(shù)期間和之后的嚴(yán)重全身炎癥反應(yīng)有關(guān)。在 CPB 患者的血漿中一直觀察到促炎細(xì)胞因子，特別是 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α的激增。

盡管全身炎癥與器官損傷密切相關(guān)，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。一個(gè)主流假設(shè)是 CPB 激活炎性白細(xì)胞，在 CPB 后外滲并浸潤(rùn)到不同的器官，導(dǎo)致器官功能障礙。炎性白細(xì)胞（包括分化的巨噬細(xì)胞）將細(xì)胞因子和破壞性可溶性因子釋放到周?chē)M織，這些細(xì)胞也可能在浸潤(rùn)時(shí)死亡，因?yàn)?CPB 和特別高的剪切應(yīng)力被證明能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞死亡。壞死是細(xì)胞死亡的炎癥模式，被認(rèn)為比細(xì)胞凋亡更具破壞性。迄今為止，CPB 激活的白細(xì)胞死亡和細(xì)胞死亡的確切模式（如果確實(shí)發(fā)生）的實(shí)驗(yàn)證據(jù)仍然缺乏。

基于此，美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院心臟病學(xué)系、加州大學(xué)圣地亞哥分校醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系及西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院心血管外科團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究曾使用兒科患者樣本、幼豬 CPB 模型和新開(kāi)發(fā)的體外 CPB 模型來(lái)表征 CPB 及其特異因子如何誘導(dǎo)全身炎癥的分子機(jī)制。研究確定了高剪切應(yīng)力是一種 CPB 特異性因子，足以通過(guò)鈣依賴性信號(hào)通路顯著上調(diào)人單核細(xì)胞中 IL-8 和 TNF-α 的生成；且發(fā)現(xiàn)CPB 誘導(dǎo)的大量炎性單核細(xì)胞亞群死于細(xì)胞凋亡和 TNF α介導(dǎo)的壞死性凋亡，這可能導(dǎo)致 CPB 后的組織損傷。研究成果發(fā)表于 JCI Insight 期刊題為“Shear stress associated with cardiopulmonary bypass induces expression of inflammatory cytokines and necroptosis in monocytes”。

首先，對(duì)新生兒心臟手術(shù)患者采集的白細(xì)胞進(jìn)行mRNA測(cè)序。每簇基因的通路富集分析表明，在所有時(shí)間點(diǎn)，骨髓細(xì)胞都有很強(qiáng)的活化，特別是粒細(xì)胞粘附以及 IL-6 和 IL-8 信號(hào)。隨著時(shí)間推移，胞吐作用、IL-10 介導(dǎo)的抗炎細(xì)胞因子信號(hào)、TLR 信號(hào)和白細(xì)胞遷移逐漸增加。細(xì)胞類(lèi)型特異性基因集富集分析證實(shí)了骨髓細(xì)胞，尤其是單核細(xì)胞，是驅(qū)動(dòng)整體轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的主要細(xì)胞類(lèi)型。由于炎性細(xì)胞因子是 CPB 后患者全身炎癥的標(biāo)志，因此分析了 mRNA-Seq 數(shù)據(jù)中 IL1B、IL6、IL8 和 TNFA  4 種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄變化，兒科患者白細(xì)胞樣本和幼豬 CPB 模型均顯示僅發(fā)現(xiàn) IL8 和 TNFA 的上調(diào)，而未檢測(cè)到 IL6。這些數(shù)據(jù)表明，暴露于 CPB 條件足以上調(diào)白細(xì)胞中 IL8 和 TNFA 的表達(dá)。

為了研究 CPB 誘導(dǎo)單核細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生的分子機(jī)制，將 THP-1 細(xì)胞（一種來(lái)自嬰兒的人單核細(xì)胞系）暴露于體外 CPB 條件中，并施加大范圍剪切應(yīng)力（圖1 A）。與靜態(tài)對(duì)照相比，體外 CPB 條件在 THP-1 細(xì)胞中強(qiáng)烈上調(diào) IL-8 和 TNF-α 的轉(zhuǎn)錄物和蛋白水平（圖1 B、C），IL1B 表達(dá)沒(méi)有顯著改變，且在2.1 Pa 剪切力處理的 THP-1 細(xì)胞中未檢測(cè)到 IL-1B 和 IL-6 蛋白水平的變化。這表明，體外CPB回路在上調(diào)IL-8和TNF-α方面概括了體內(nèi)CPB數(shù)據(jù)。

與 CPB 回路相關(guān)的三個(gè)因素是暴露于 PVC、高剪切應(yīng)力和快速冷卻/再加熱。為了剖析每種因素的影響，將靜態(tài) THP-1 細(xì)胞與 PVC 管一起孵育，發(fā)現(xiàn)在37°C下單獨(dú)暴露于 PVC使IL8 的分泌上調(diào)了約 5 倍，而 TNFA 水平?jīng)]有顯著改變（圖1 D）。

當(dāng)細(xì)胞在 37°C 下進(jìn)行剪切處理以消除冷卻/復(fù)溫效應(yīng)，或暴露于 0.63 Pa 的較低剪切應(yīng)力下時(shí)，IL-8 和 TNF-α 在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上的上調(diào)顯著降低（圖1 E、F）。特別是對(duì)于 IL8，在2.1 Pa高剪切應(yīng)力和30°C低溫的CPB條件下，與靜態(tài)對(duì)照相比，IL8水平提高了約330倍（圖1 E）。

當(dāng)細(xì)胞在 37°C 下承受 2.1 Pa 的高剪切應(yīng)力時(shí)，與靜態(tài)對(duì)照相比，IL8 上調(diào)約 124 倍（圖1 E），這表明，冷卻/復(fù)溫的效果導(dǎo)致 IL8 水平的差異約為 2.7 倍。由于 PVC 暴露僅將 IL8 上調(diào)約 5 倍，因此推測(cè)與靜態(tài)條件相比，剪切應(yīng)力對(duì) THP-1 細(xì)胞中 IL8 mRNA 水平提升的貢獻(xiàn)最大。這種比較證明了剪切應(yīng)力在 3 個(gè) CPB 特異性因素中的主導(dǎo)效應(yīng)，但沒(méi)有考慮協(xié)同作用的可能性。

圖1    體外CPB條件上調(diào)THP-1細(xì)胞中的IL-8和TNF-α。

接下來(lái)，研究了鈣是否對(duì) CPB 激活的細(xì)胞因子生成至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞在無(wú)鈣培養(yǎng)基中進(jìn)行剪切處理或當(dāng)鈣離子螯合劑 EGTA 螯合細(xì)胞外鈣時(shí)，與對(duì)照培養(yǎng)基相比，CPB 誘導(dǎo)的 IL-8 和 TNF-α 的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平的上調(diào)明顯減弱（圖2），表明鈣內(nèi)流對(duì)于這種轉(zhuǎn)錄反應(yīng)至關(guān)重要。

然后，利用抑制劑研究了特定鈣介導(dǎo)的信號(hào)通路。結(jié)果觀察到，MEK/ERK 通路的激活驅(qū)動(dòng) IL8 和 TNFA 的表達(dá)以響應(yīng) CPB。CPB也激活了 CaN/NFAT 通路。剪切處理后人原代 CD14+ 單核細(xì)胞的 Western blot 分析也支持 MEK/ERK/AP-1 和 CaN/NFAT 通路的激活。PKC 抑制劑 Go 6983 和 Sotrastaurin 可有效抑制 IL8 和 TNFA 上調(diào)，但 Western blot 分析未顯示 NF-κB 通路的激活，表明 PKC 抑制劑的抑制作用可能是由于 PKC 激活 MEK/ERK 通路的串?dāng)_。

由于鈣信號(hào)通路可以串?dāng)_和募集不同的轉(zhuǎn)錄因子，因此檢測(cè)了剪切處理的 THP-1 細(xì)胞中 4 種轉(zhuǎn)錄因子 NFAT、AP-1（p-c-JUN）、NF-κB p65 和 p-CREB 的核定位，發(fā)現(xiàn)只有 NFAT1 和 p-c-JUN 顯示出明顯的核定位，這被EGTA 抑制，但未檢測(cè)到 NF-κB p65 或 p-CREB 染色。這表明，MEK/ERK/AP-1 和 CaN/NFAT 是 CPB 條件下激活的主要鈣信號(hào)通路。

此外，與靜態(tài)細(xì)胞相比，CPB 誘導(dǎo)的 IL8 啟動(dòng)子激活導(dǎo)致剪切處理的 THP-1 細(xì)胞的熒光素酶活性增加約 1.5 倍。當(dāng) AP-1 的結(jié)合位點(diǎn) #1 或 NFAT 的結(jié)合位點(diǎn) #2 被刪除時(shí)，剪切后熒光素酶活性沒(méi)有增加。這些結(jié)果證實(shí)，AP-1 和 NFAT 在這 2 個(gè)相鄰結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合激活了 THP-1 細(xì)胞中的 IL8 轉(zhuǎn)錄。

圖2    細(xì)胞外鈣對(duì)于 CPB 誘導(dǎo)的 IL-8 和 TNF-α 上調(diào)至關(guān)重要。

（A 和B）當(dāng) THP-1 細(xì)胞在無(wú)鈣培養(yǎng)基或鈣螯合劑 EGTA 存在下暴露于剪切應(yīng)力時(shí)，與相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基相比，IL8（A）和 TNFA（B）的 mRNA 上調(diào)明顯減弱。（C） 在無(wú)鈣培養(yǎng)基中剪切處理的 THP-1 細(xì)胞中 IL-8 和 TNF-α 的蛋白水平顯著低于對(duì)照培養(yǎng)基。

研究發(fā)現(xiàn)，在暴露于體外 CPB 系統(tǒng) 2 小時(shí)后，大約 1.6% 的 THP-1 細(xì)胞立即破裂，可能是由于機(jī)械破壞。有趣的是，大量非貼壁 THP-1 細(xì)胞隨著時(shí)間的推移而死亡，具有凋亡和壞死細(xì)胞死亡的形態(tài)特征。細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Q4的活細(xì)胞群隨著時(shí)間的推移顯著減少，Q3 的早期凋亡細(xì)胞數(shù)量在 24 小時(shí)后增加到約 13% ，Q2 中的壞死細(xì)胞提示晚期凋亡細(xì)胞、原發(fā)性壞死細(xì)胞或繼發(fā)性壞死細(xì)胞，在 24 小時(shí)后顯著增加至約 40%。Western blot 分析顯示，隨著時(shí)間的推移，剪切處理的 THP-1 細(xì)胞中壞死性凋亡通路中關(guān)鍵蛋白（p-RIPK1、p-RIPK3 和 p-MLKL）的水平增加，凋亡標(biāo)志物水平也增加。該結(jié)果表明，THP-1 細(xì)胞在 CPB 后死于細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡。

最后，研究人員探討了細(xì)胞死亡是由可藥物因子/信號(hào)通路精確介導(dǎo)的，還是僅僅是機(jī)械損傷的不可避免的結(jié)果。暴露于 CPB 條件將 THP-1 細(xì)胞更換為新鮮培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)可以挽救細(xì)胞死亡（圖3 A、B）。實(shí)驗(yàn)假設(shè)，要么是破裂細(xì)胞的不溶性殘余物，要么是剪切處理中的可溶性因子導(dǎo)致細(xì)胞死亡，然后發(fā)現(xiàn)從剪切后的培養(yǎng)基中去除殘余物或?qū)堄辔锾砑拥叫迈r培養(yǎng)基中不會(huì)改變細(xì)胞死亡的百分比（圖3 B）。這一結(jié)果強(qiáng)烈表明，剪切處理的 THP-1 細(xì)胞釋放到上清液中的可溶性因子導(dǎo)致了細(xì)胞死亡。

由于 TNF-α 是已知的細(xì)胞死亡介質(zhì)，因此研究了靶向可溶性 TNF-α 是否可以減少壞死性凋亡。用人源化 TNF-α 抗體處理的剪切 THP-1 細(xì)胞的壞死細(xì)胞死亡減少約 24%（圖3 C）。介導(dǎo) TNF-α 細(xì)胞效應(yīng)的受體 TNFR1的敲除可將壞死細(xì)胞死亡減少約 41%（圖3 D），并降低了裂解 caspase-3 和 p-RIPK1 的水平（圖3 E）。這些數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞死亡部分是由 TNF-α 介導(dǎo)的。此外，當(dāng)用人重組 IL-8、TNF-α 或兩者處理初始靜態(tài) THP-1 細(xì)胞時(shí)，IL-8 和 TNF-α 的組合比單獨(dú)使用 TNF-α 處理誘導(dǎo)更多的細(xì)胞死亡。這表明，雖然 IL-8 不直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但它可能與 TNF-α協(xié)同作用驅(qū)動(dòng)細(xì)胞死亡。

圖3    CPB 誘導(dǎo)的壞死性凋亡部分由 TNF-α 介導(dǎo)。

圖4    CPB 誘導(dǎo)的炎癥和器官損傷機(jī)制的模型。

CPB 條件，特別是高水平的剪切應(yīng)力，通過(guò)鈣介導(dǎo)的 MEK/ERK/AP-1 和 CaN/NFAT 通路激活單核細(xì)胞并上調(diào)炎性細(xì)胞因子 IL-8 和 TNF-α 的產(chǎn)生?；罨膯魏思?xì)胞粘附并通過(guò)血管內(nèi)皮遷移到外周器官，隨著時(shí)間的推移分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞與剩余的活炎性單核細(xì)胞一起，將細(xì)胞因子、趨化因子和破壞性可溶性因子分泌到周?chē)M織環(huán)境中?；罨瘑魏思?xì)胞亞群因細(xì)胞凋亡和 TNF α 介導(dǎo)的壞死性凋亡而死亡。壞死性凋亡單核細(xì)胞破裂并釋放 DAMPs進(jìn)一步損害器官。靶向 MEK/ERK/AP-1 和 CaN/NFAT 通路以減少單核細(xì)胞活化或中和 TNF-α 以防止壞死性凋亡，可以改善 CPB 后器官損傷。

這項(xiàng)研究shouci分析了新生兒CPB期間和之后循環(huán)白細(xì)胞的全球轉(zhuǎn)錄變化?？傊撗芯客ㄟ^(guò)證明單核細(xì)胞活化在全身炎癥中的關(guān)鍵作用以及炎性單核細(xì)胞死亡在組織損傷中的關(guān)鍵作用，使我們更接近于從機(jī)制上解開(kāi)CPB中復(fù)雜的全身性炎癥反應(yīng)。除了轉(zhuǎn)化潛力外，該研究還為響應(yīng)流體剪切應(yīng)力的循環(huán)白細(xì)胞的基本生物學(xué)提供了潛在的新理解。

參考文獻(xiàn)：Tu LN, Hsieh L, Kajimoto M, Charette K, Kibiryeva N, Forero A, Hampson S, Marshall JA, O'Brien J, Scatena M, Portman MA, Savan R, Benner C, Aliseda A, Nuri M, Bittel D, Pastuszko P, Nigam V. Shear stress associated with cardiopulmonary bypass induces expression of inflammatory cytokines and necroptosis in monocytes. JCI Insight. 2021 Jan 11;6(1):e141341. doi: 10.1172/jci.insight.141341. PMID: 33232305; PMCID: PMC7821587.

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