RPL35 downregulated by mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development via Hedgehog-Gli1 signaling

Keywords: Chondrocyte; Hedgehog pathway; Osteoarthritis; Ribosomal protein L35; Senescence.

骨關(guān)節(jié)炎（OA）的特征是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變和受累關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)丟失，導(dǎo)致慢性疼痛、運(yùn)動(dòng)受限，最終降低生活質(zhì)量。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組成，其退變降解的過程主要由一系列軟骨基質(zhì)降解酶所介導(dǎo)。細(xì)胞衰老是與ECM降解和軟骨細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)的另一個(gè)因素。在病理狀態(tài)下，軟骨細(xì)胞可能會(huì)去分化，失去其功能表型，并趨向衰老。在培養(yǎng)過程中，軟骨細(xì)胞衰老和去分化伴隨著軟骨細(xì)胞特異性蛋白（如II型膠原和糖蛋白）表達(dá)的降低。

軟骨細(xì)胞維持軟骨組織形態(tài)，對(duì)機(jī)械刺激是非常敏感的。生理范圍內(nèi)的機(jī)械負(fù)荷對(duì)于維持軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是必要的。然而，由肥胖、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、勞損或創(chuàng)傷引起的異常負(fù)荷可導(dǎo)致軟骨退變，并且是與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展相關(guān)的重要危險(xiǎn)因素。

核糖體蛋白在機(jī)體的生長發(fā)育以及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。既往研究表明，lncNB1通過結(jié)合核糖體蛋白L35（RPL35）誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和存活，而高水平的RPL35與腫瘤預(yù)后相關(guān)。RPL35作為核糖體60s的小亞基在蛋白質(zhì)合成中起著至關(guān)重要的作用，如RPL35通過RPL35/ERK/HIF1α軸上調(diào)HIF1α促進(jìn)有氧糖酵解。

基于此，廣東省骨與關(guān)節(jié)退行性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的科研團(tuán)隊(duì)在最近的一項(xiàng)研究中詳細(xì)闡述了機(jī)械應(yīng)力與細(xì)胞衰老之間的關(guān)系，并確定了 RPL35 蛋白表達(dá)的降低在過度機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)的軟骨細(xì)胞衰老中起著關(guān)鍵介質(zhì)的作用。該研究表明，外源性添加 RPL35 可以減輕應(yīng)力負(fù)荷誘導(dǎo)的Hedgehog（Hh）通路的激活。這表明關(guān)節(jié)內(nèi)注射 RPL35 可作為 OA 治療方法的潛力。研究成果發(fā)表在 Journal of Orthopaedic Translation 期刊題為“RPL35 downregulated by mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development via Hedgehog-Gli1 signaling”。

過度機(jī)械負(fù)荷被認(rèn)為是研究骨關(guān)節(jié)炎生理特征的良好模型，為了鑒定機(jī)械負(fù)荷后對(duì)軟骨細(xì)胞的重要基因，施加 5%、10% 或20% 的0.5 Hz循環(huán)拉伸應(yīng)力24小時(shí)，并進(jìn)行 RNA 測序分析。差異表達(dá)分析揭示了459個(gè)差異表達(dá)的基因。與正常軟骨細(xì)胞相比，過度機(jī)械負(fù)荷（20%）處理的軟骨細(xì)胞中RPL35 基因表達(dá)表現(xiàn)出下調(diào)。進(jìn)一步驗(yàn)證RPL35與過度機(jī)械負(fù)荷處理的軟骨細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)過度機(jī)械應(yīng)力不僅促進(jìn)了分解代謝效應(yīng)，而且刺激了軟骨細(xì)胞衰老。

已知促炎細(xì)胞因子，如IL-1β和TNF-β，在OA的發(fā)病機(jī)制中起作用。因此，使用重組 IL-1β 刺激的原代小鼠軟骨細(xì)胞建立了 OA 模型，WB結(jié)果顯示，與正常軟骨細(xì)胞相比，IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中RPL35降低。這些數(shù)據(jù)表明，過度機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)體外衰老軟骨細(xì)胞中RPL35下調(diào)。

為了評(píng)估體外研究結(jié)果是否可以在體內(nèi)應(yīng)用，構(gòu)建機(jī)械性超負(fù)荷引起的OA，將右膝關(guān)節(jié)給予60次 4、9和13.5 N的軸向壓縮負(fù)荷，在人 OA 中檢測了 RPL35 蛋白水平。IHC染色結(jié)果顯示，與輕度損傷的外側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨樣本相比，接受全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的OA患者脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)RPL35蛋白水平降低（圖1 A、B）。當(dāng)使用膝關(guān)節(jié)承受0.5 N的靜態(tài)軸向壓縮負(fù)荷10 分鐘的OA小鼠模型時(shí)觀察到相同的結(jié)果，即與正常軟骨相比，RPL35 蛋白水平在 OA 小鼠中呈現(xiàn)進(jìn)行性下調(diào)，并伴有軟骨損傷增加（圖1 C-E）。進(jìn)一步分析機(jī)械負(fù)荷對(duì)關(guān)節(jié)軟骨衰老的影響，在 13.5 N 的機(jī)械壓縮作用2-4周后，發(fā)現(xiàn)小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中MMP13-、P16- 和P21- 陽性軟骨細(xì)胞的數(shù)量增加，Col2- 陽性軟骨細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。這表明，機(jī)械超負(fù)荷加速了關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨細(xì)胞衰老。

番紅O 染色顯示，在 13.5 N 的峰值壓縮負(fù)荷下持續(xù)多次刺激 2 或 4 周可誘導(dǎo)小鼠膝關(guān)節(jié)蛋白多糖的丟失。然而，在 4 N 和 9 N 的刺激下，軟骨細(xì)胞沒有顯著變化（圖1 F、G）。IHC 軟骨染色同樣證實(shí)，在施加 13.5 N 的過大機(jī)械壓縮后，軟骨細(xì)胞 RPL35 蛋白水平顯著下降（圖1 F-K）。這些發(fā)現(xiàn)揭示了 RPL35 蛋白水平隨著 OA 的進(jìn)展而降低，表明 OA 嚴(yán)重程度與 RPL35 表達(dá)之間存在關(guān)聯(lián)。

圖1   軟骨細(xì)胞RPL35水平因機(jī)械超負(fù)荷而降低，OA關(guān)節(jié)軟骨的RPL35水平下降。

接下來，通過敲低 RPL35以探索其在 OA 進(jìn)展中的作用，評(píng)估了RPL35的缺失是否驅(qū)動(dòng)原代小鼠軟骨細(xì)胞的退變。結(jié)果顯示，RPL35敲低降低了Col2水平，增加了MMP13、P16和P21的水平。此外，還通過關(guān)節(jié)注射研究了 RPL35 在體內(nèi)的作用，觀察到體內(nèi)敲低 RPL35 后軟骨細(xì)胞中 RPL35 的表達(dá)顯著降低，且這種降低伴隨著軟骨的退行性變化。在關(guān)節(jié)軟骨承受過大機(jī)械應(yīng)力的小鼠中也觀察到了類似現(xiàn)象，但并未觀察到其敲低加劇了骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。

然后，通過過表達(dá)RPL35以探索其對(duì)軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的影響，構(gòu)建RPL35過表達(dá)（Ad-RPL35）和陰性對(duì)照（Ad-NC）載體。在關(guān)節(jié)內(nèi)注射 Ad-RPL35 的機(jī)械負(fù)荷小鼠中，與接受機(jī)械負(fù)荷和 Ad-NC 處理的小鼠相比，OA 的嚴(yán)重程度顯著降低，且未觀察到軟骨損傷。有趣的是，IHC結(jié)果顯示，RPL35表達(dá)的變化與上述分析的關(guān)節(jié)軟骨損傷程度的變化趨勢(shì)一致（圖2 A）。此外，與對(duì)照組相比，機(jī)械負(fù)荷處理4-6周的小鼠中，MMP13-、P16-和P21- 陽性軟骨細(xì)胞的數(shù)量增加，而Col2- 陽性軟骨細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。RPL35 的添加緩解了退行性病變（圖2 B）。此外，過度的機(jī)械負(fù)荷刺激促進(jìn)了這些衰老因子的表達(dá)，而 RPL35 的添加在體外逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)（圖2 C、D），表明其對(duì)軟骨細(xì)胞衰老的保護(hù)作用。

圖2   RPL35在軟骨細(xì)胞中的過表達(dá)可防止機(jī)械誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老和OA發(fā)展。

最后，研究人員試圖確定哪種信號(hào)通路負(fù)責(zé)RPL35 敲低后誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞衰老。因此，鑒定了 4989 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本大部分在 Hedgehog（Hh）通路中富集。qPCR結(jié)果顯示，敲低RPL35或過度機(jī)械負(fù)荷導(dǎo)致軟骨細(xì)胞GLI-1和SMO表達(dá)增加，它們是 Hh 通路激活的標(biāo)志物。IHC 和 IF 均表明，在過度機(jī)械負(fù)荷下軟骨中 SMO、Gli-1 和 PTCH1 Hh 信號(hào)增加，而添加 RPL35 恢復(fù)了 SMO、Gli-1 和 PTCH1 的表達(dá)。這些結(jié)果說明了RPL35對(duì)Hh通路的抑制作用。

此外，還確定了 Hh 的激活是否有助于 RPL35 缺失誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老，發(fā)現(xiàn)在原代小鼠軟骨細(xì)胞中，Hh 通路抑制劑環(huán)巴胺（Cyclopamine）部分降低了 RPL35 缺失誘導(dǎo)的 P21、P16 和 MMP13 的蛋白表達(dá)水平。上述結(jié)果表明，Hh通路激活升高至少在一定程度上導(dǎo)致了RPL35缺失引起的關(guān)節(jié)軟骨退化。

通路分析顯示，與正常軟骨細(xì)胞相比，用RPL35 siRNA處理的原代軟骨細(xì)胞中，有17個(gè)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本介導(dǎo)Hh信號(hào)通路，其中酪蛋白激酶1ε（CK1ε）是突出的（圖3 A、B）。qPCR和WB分析顯示，軟骨細(xì)胞中RPL35的敲低提高了內(nèi)源性CK1ε水平（圖3 C）。此外，在過度機(jī)械負(fù)荷處理的軟骨細(xì)胞中也觀察到 CK1ε 水平升高，而添加 RPL35 恢復(fù)了 CK1ε 的表達(dá) （圖3 D）。IF染色分析也觀察到相同的趨勢(shì)（圖3 E）。

因此，探討了CK1ε在OA發(fā)展中的作用。與正常軟骨細(xì)胞相比，CK1ε 過表達(dá)的軟骨細(xì)胞 MMP13 水平升高、Col2 水平降低以及衰老相關(guān)標(biāo)志物 P16 和 P21 水平升高，而敲低CK1ε 則具有保護(hù)作用（圖3 F）。此外，還探索了siRPL35是否通過靶向CK1ε/SMO信號(hào)來調(diào)控OA過程，WB結(jié)果表明，RPL35敲低的影響被CK1ε敲低顯著減弱（圖3 G）。此外，RPL35 敲低后 CK1ε 水平升高，并與 SMO 共定位增加（圖3 H），進(jìn)一步提示了CK1ε激活SMO的可能性。總之，這些數(shù)據(jù)表明，抑制RPL35 可導(dǎo)致 OA，可能是通過提高 CK1ε 蛋白水平，從而與 SMO接觸激活，最終激活 Hh 通路。

圖3    RPL35 通過 Csnk1e（CK1ε）調(diào)節(jié) Hh 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。

圖4     圖形概要

綜上所述，該研究明確了RPL35和CK1ε在OA中的作用和聯(lián)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了CK1ε在關(guān)節(jié)軟骨中的過表達(dá)激活了Hh通路，表明RPL35的缺失和CK1ε-Hh信號(hào)通路的激活在生物力學(xué)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老和退變中起著關(guān)鍵作用。因此，靶向關(guān)節(jié)內(nèi)補(bǔ)充 RPL35 是減緩 OA 發(fā)展的一種方式。

參考文獻(xiàn)：Zhu J, Liu L, Lin R, Guo X, Yin J, Xie H, Lu Y, Zhang Z, Zhang H, Yao Z, Zhang H, Wang X, Zeng C, Cai D. RPL35 downregulated by mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development via Hedgehog-Gli1 signaling. J Orthop Translat. 2024 Apr 1;45:226-235. doi: 10.1016/j.jot.2024.01.003. PMID: 38596341; PMCID: PMC11001632.

Impact Factor  5.9

Print ISSN: 2214-031X

Online ISSN: 2214-0328

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