簡介

藥物是一種由化學(xué)或生物來源制成的產(chǎn)品，用于人類或動物的醫(yī)療治療，這些藥物往往以化學(xué)合成的形式來生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成是一種通常伴隨著雜質(zhì)存在的過程，因為產(chǎn)率很少是 100%。這些雜質(zhì)可能會對最終產(chǎn)品的療效、安全性和質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。因此，對藥物進(jìn)行純化以確保合成化合物的純度和完整性是至關(guān)重要的，藥物的純化可以通過色譜法等多種方法進(jìn)行。

最近，超臨界流體色譜（SFC）已經(jīng)作為一種替代反相液相色譜（RP-HPLC）的方法出現(xiàn)。SFC 使用超臨界二氧化碳作為流動相的一部分，這是一種清潔且環(huán)保的溶劑，很容易從最終產(chǎn)品中去除。此外，SFC 結(jié)合了氣相色譜和液相色譜的優(yōu)點，在提供高分辨率的同時也能以更快的速度分離樣品。

在 SFC 的方法開發(fā)過程中，最大的難點在于沒有一種通用的固定相。因此需要在不同的固定相上進(jìn)行篩選，以確定要分離的樣品的最好選擇性。CO₂ 的低極性溶劑特性允許在色譜柱篩選時同時考慮非極性和強(qiáng)極性的固定相。在確定最佳固定相后，就可以進(jìn)一步放大到制備規(guī)格。

在本次應(yīng)用中，我們會例舉利多卡因和乙酰氨基酚的合成案例，利用 SFC 系統(tǒng)來高效去除合成過程中的雜質(zhì)，獲取高純度目標(biāo)化合物。在這一過程中，需要先進(jìn)行合適色譜柱的篩選，再放大至制備色譜的規(guī)格。

設(shè)備

• BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色譜系統(tǒng)

• BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)

• BUCHI PrepPure 硅膠，5um,250×4.6mm 

• BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×4.6mm 

• BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×4.6mm 

• BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×4.6mm 

• HILIC柱，5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)

• BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm 

• BUCHI PrepPure CBD，5um,250×4.6mm 

• 氰基柱，5um,250×10mm ，(Dr. Maisch GmbH)

• BUCHI PrepPure PEI，5um,250×10mm 

• BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×10mm

化學(xué)品與樣品

化學(xué)品：

• 二氧化碳 (99.9%)

• 甲醇 (≥99%)

• 甲醇溶液中2M的氨溶液

• 甲酸（99%）

• 去離子水

為了安全處理，請注意所有相應(yīng)的MSDS！

樣品：

• 乙酰氨基酚合成產(chǎn)物

• 利多卡因合成產(chǎn)物

程序設(shè)定

BUCHI Sepmatix 8x SFC平行色譜系統(tǒng)

• 流動相：A= 二氧化碳；B= 甲醇

• 柱尺寸：250×4.6mm

• 流速：3mL/min（每根色譜柱）

• 檢測：DAD 紫外掃描 200 nm - 600 nm

• 流動相條件：

篩選過程自動運(yùn)行，流速設(shè)置為 3mL/min 每通道，使用流控單元，平衡每一根色譜柱。樣品自動注入（V = 5 μL），并開始平行篩選（運(yùn)行時間 =10min）。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar，柱子加熱至 32℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。

BUCHI Sepiatec SFC-50超臨界制備色譜系統(tǒng)

• 流動相：A= 二氧化碳；B= 甲醇

• 柱尺寸：250×10mm

• 流動相條件：等度運(yùn)行條件

• 檢測：紫外

所有 10mm ID 色譜柱都在預(yù)設(shè)流速下平衡 3 分鐘，使用自動進(jìn)樣器上樣，并開始運(yùn)行。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar，柱子加熱至 40℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。

結(jié)果

5.1 乙酰氨基酚

乙酰氨基酚（下稱 AA），也常被稱為對乙酰氨基酚，是一種鎮(zhèn)痛劑、解熱劑和手性藥物。它屬于非阿片類鎮(zhèn)痛劑這一類。在化學(xué)上，它可以通過對氨基苯酚（下稱 AP）與乙酸酐的反應(yīng)來合成，在此過程中發(fā)生 N-乙?；ㄒ?strong style="box-sizing: border-box;">圖1）。為了確定乙酰氨基酚合成產(chǎn)物的最佳純化分離固定相，首先進(jìn)行了柱篩選（見圖1）。

圖1顯示，二醇基和 2-EP 相并未表現(xiàn)出分離度，硅膠相、CBD 相、氰基相和氨基相未顯示出理想的分離度，因為它們無法實現(xiàn)基線分離。HILIC 和 PEI 相具有良好的選擇性和分辨率，且分辨率始終遠(yuǎn)高于 1.5（見表1）。1.5 的分辨率意味著可以很好地分離 2 個峰。表1 還顯示了洗脫順序，氰基相顯示出相反的洗脫趨勢，對氨基苯酚先洗脫，然后是對乙酰氨基酚。篩選結(jié)果表明，反應(yīng)并非100，因為產(chǎn)物中仍含有大量對氨基苯酚。

選擇 PEI 相色譜柱放大至制備規(guī)格，因為它具有最高的分辨率（見圖2）。根據(jù)篩選時的色譜圖，我們可以確定 AA 和 AP 在甲醇為 35−40% 之間洗脫。圖2（頂部）顯示了在 40% 甲醇等度條件下，在 10 x 250mm 的PEI 色譜柱上對 AA 進(jìn)行純化的情況，結(jié)果顯示 AA 和 AP 可以非常良好地分離。因此在相同的條件下，可以實施一個堆疊注射方法，用于自動純化并收集 AA （見圖2，底部）。

5.2 利多卡因

利多卡因（下稱 L），化學(xué)名為 2-二乙基氨基 -N-(2,6-二甲基苯)乙酰胺，是一種用作局部麻醉劑和抗心律失常藥物的藥物，它作為鈉通道阻斷劑起作用。利多卡因可以通過兩步合成過程生產(chǎn)（見圖3）。第一步中，2,6-二甲基苯胺（下稱 X）的氨基組團(tuán)被?；?。第二步中，中間產(chǎn)物（下稱 IP）通過與二甲胺的親核取代反應(yīng)轉(zhuǎn)化為利多卡因。因此，需要進(jìn)行兩步純化過程。色譜柱篩選的結(jié)果如圖3所示，篩選過程中，在改性劑甲醇中始終添加 20 毫摩爾氨水作為堿性添加劑。

從結(jié)果來看，所有色譜柱都可用于中間體 IP 的第一步純化分離，因為都具有基線分離的效果。其中氨基相具有最高的分辨率，且在甲醇比例較低時就能出峰（見圖3）。對于第二步利多卡因的純化，氰基和CBD相無法實現(xiàn)基線分離，而氨基再次表現(xiàn)出最佳的分離度（見表2）。在洗脫順序上，第一步中間體的純化出峰順序都是先 X 再 IP，而第二步的利多卡因的純化除了硅膠相之外都是先 L 再 IP（見表2）。

最終選擇 10 x 250mm 的氨基色譜柱進(jìn)行制備純化，因為它的分辨率總是最高的（見表2）。氨基柱篩選結(jié)果顯示，X 和 IP 出峰時的甲醇比例約為 10 - 19%，L 和 IP 出峰時的甲醇比例約為 11 - 19%。圖 4 a) 顯示的是甲醇比例為 16% 等度條件下的 IP 的單次純化分離圖譜，圖 4 b) 顯示的是甲醇比例為 20% 等度條件下的 L 的單次純化分離圖譜。在相同的條件下，可以進(jìn)行疊層進(jìn)樣分離，分別自動純化 IP 和 L，并進(jìn)行餾分收集（見圖 4 c) 和 d)）。

結(jié)論

在進(jìn)行有機(jī)合成后，由于副反應(yīng)或轉(zhuǎn)化率未達(dá)到 100%，通常仍會存在雜質(zhì)，這些雜質(zhì)必須去除，尤其是在藥品生產(chǎn)中。

在藥物合成研發(fā)領(lǐng)域，時間與效率至關(guān)重要。BUCHI 的 SFC 色譜解決方案為研發(fā)人員提供了強(qiáng)大的工具，通過 Sepmatix 8x SFC 色譜柱篩選系統(tǒng)與 Sepiatec SFC-50 制備色譜系統(tǒng)相結(jié)合，可快速篩選出合適的色譜柱并線性放大至制備規(guī)格。SFC-50 的疊層進(jìn)樣功能，不僅能實現(xiàn)無人值守自動分離，還可顯著提高分離效率，從而加快藥物合成研發(fā)的速度。

參考文獻(xiàn)

1. Medikamente & Medizinprodukte (admin.ch) (Status 23.11.2023).

2. doi.org/10.1016/j.chroma.2011.09.029

3. doi.org/10.1016/j.chroma.2012.06.029

4. doi.org/10.1016/j.chroma.2005.03.073

5. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2007.08.013.

6. PRACTICAL APPLICATION OF SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY FOR PHARMACEUTICAL RESEARCH AND DEVELOPMENT, Vol. 14, M. Hicks and P. Ferguson, 2022 Elsevier Inc.

7. Th. Eicher und H. J. Roth; Synthese, Gewinnung und Charakterisierung von Arzneistoffen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1986).

8. The synthesis of Lidocaine (University of San Diego).

9. Winterfeld, K. – Praktikum der organisch-präparativen Pharmazeutischen Chemie, 6. Auflage, Steinkopff Verl., Darmstadt (1965).

10. Axel Kleemann, Jürgen Engel, Bernd Kutscher und Dietmar Reichert: Pharmaceutical Substances, 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (2000).