你知道如何去除重組蛋白的融合標簽嗎？來看看吧！

百歐博偉生物：由于基因工程技術的發(fā)展，人們可以自由地將各種基因進行隨意的進行組合，表達出多種功能的蛋白質。蛋白融合標簽技術作為 DNA 重組技術的代表，通過在基因水平上改造目標蛋白，產生含有融合標簽的重組蛋白，兼具了原有蛋白質的功能活性和融合標簽所的生理生化特性。隨著蛋白藥物的飛速發(fā)展，融合標簽技術被廣泛地應用于科研及醫(yī)藥工業(yè)領域，尤其在蛋白質分離純化、膜蛋白結構研究、蛋白質生化功能研究等方面有著重要作用。

雖然融合標簽具有十分多的優(yōu)點，可以使蛋白的純化更加的快捷方便、能夠促進目的蛋白的正確折疊和可溶表達、利于蛋白質的表達和定位等；但是有時對目標蛋白也會造成不利影響。其主要表現(xiàn)在：①融合標簽可能會影響目標蛋白的構象。例如蛋白連接GST標簽后，雖然蛋白質的可溶性增加了，但是蛋白質構象卻發(fā)生了很大的變化。因此，在研究蛋白質結構時，需要移除融合標簽，排除融合標簽對蛋白質結構的影響；②融合標簽可能會抑制和影響目標蛋白的活性。例如，對用于癌癥治療的單抗 CC49 單鏈 Fv 片段(scFv)的研究表明，當多聚組氨酸標簽與 scFv 的 C 端相連接時，會對 scFv 部分抗原結合位點進行覆蓋，從而降低 scFv 對抗原的結合能力。

在研究蛋白質或酶的性質或功能時，往往需要考慮融合標簽的對其是否有影響。對于藥用蛋白質，融合標簽可能會對目標蛋白的藥效產生不利影響，此外還會對人體健康存在潛在影響，因而很有必要將融合標簽進行去除。

移除融合標簽最長常用的方法可分為：化學法、外切蛋白酶法、內切蛋白酶法和基于內含肽的自我剪切法。

一、化學法

化學方法移除多肽標簽所采取的基本策略為：在目標蛋白與融合標簽之間插入一個甲硫氨酸殘基，蛋白被誘導表達和純化后，用溴化氰或羥胺處理該融合蛋白，使目標蛋白與融合標簽在插入的甲氨酸殘基處斷裂，從而使標簽和目標蛋白分開。

溴化氰(CNBr)解法是多種化學法中最重要的也是見的方法。由Gross和witkop于1962年建立的，后人進行了系統(tǒng)研究，能專一裂解甲硫氨酸殘基的羧基端，產率達到85%。由于蛋白質中的甲硫氨酸含量一般都比較少，因此裂解后的肽段較少，新生成的肽段往往是大肽段。

化學法的優(yōu)點：化學法具有效率高、耗時短、成本低等。缺點：所需的反應條件容易破壞目標蛋白的結構和功能，而且所使用的溴化氰等試劑具有毒性，此法不適合于藥用蛋白；如果目標蛋白含有內源甲氨酸殘基，會發(fā)生非特異性斷裂，導致目標蛋白被破壞；此外，化學法切割時容易產生副反應，會對一些氨基酸側鏈進行修飾從而改變目標蛋白本來的性質。

二、外切蛋白酶法

外切蛋白酶能夠從蛋白質的 N 端或 C 端開始，依次切除一個或幾個氨基酸殘基，直到遇到某種特定的氨基酸殘基才會停止切割。外切蛋白酶的種類包括氨基肽酶和羧基肽酶，分別可以切除蛋白的 N 端和 C 端的融合標簽，例如氨基肽酶M (APM)和羧肽酶 A和B(CPA和CPB)等。

對于外切蛋白酶法切除融合標簽應用中，代表性的是基于二肽氨基肽酶(DPPI，商品名為DAPase)的作用機理所提供的 TAGZyme 系統(tǒng)，用于去除 N 端的多聚組氨酸標簽。DAPase 能夠從蛋白質 N 端依次切除二肽，當?shù)鞍椎?N 端出現(xiàn) Lys、Arg、Gln 殘基，或者在 N 端第2個或第3個氨基酸殘基是Pro時，切除反應終止，酶切完成。

外切蛋白酶的作用獨立于目標蛋白內部的序列，不會造成非特異性切割，幾乎可以適用于任何目標蛋白。外切蛋白酶完成酶切的時間相對較短，也降低了造成目標蛋白變性失活可能性。外切蛋白酶完成酶切所需酶量也少于內切蛋白酶的用量，不但減少了非特異性切割的風險，還降低了后續(xù)去除該酶的難度。

三、內切蛋白酶法

內切蛋白酶能夠識別蛋白質的特定氨基酸序列，并從該序列內部或附近的特定氨基酸殘基處進行切割。使用內切蛋白酶時的一般策略：①選擇合適的內切蛋白酶，注意目標蛋白內部有多余的酶切位點；②構建表達載體時，在融合標簽與目的蛋白之間引入內切蛋白酶識別序列；③構建質粒、導入宿主并誘導表達、分離純化重組融合蛋白；④內切蛋白酶對融合蛋白進行酶切；⑤再次純化，去除內切蛋白酶和融合標簽。

在利用內切蛋白酶去除融合標簽時，內切蛋白酶的特異性和酶切效率主要受 3 種因素影響：①內切蛋白酶固有的非特異性酶切。如 Factor Xa 和凝血酶通常具有第二切割位點，并且第二位點的切割效率會隨著反應條件的不同而變化。非特異性切割可以通過優(yōu)化反應條件減少，但不能消除 ，因此在優(yōu)化條件時，需要檢測切割后的產物，以確定目標蛋白產物的均一性；②目標蛋白的結構。當融合蛋白的酶切識別位點位于蛋白質三維結構的內部時，內切蛋白酶活性中心難以識別到該位點，致使酶切效率變低。如在使用腸激酶對處于聚集狀態(tài)的目標蛋白所含的多聚組氨酸標簽的切除時，只有使目標蛋白的腸激酶的切割識別位點暴露出來后，才能獲得較高的酶切效率。③溶液中化學成分對酶切活性會產生影響，如去垢劑。在純化跨膜蛋白時，通常需要加入去垢劑，可能會影響內切蛋白酶的酶切效率。

在利用內切蛋白酶切除融合標簽之后，通常需要將內切蛋白酶除去掉。因此在內切蛋白酶時，盡量選取含有親和標簽的內切蛋白酶，在酶切完成后，通過二次過柱使帶親和標簽的內切蛋白酶吸附在柱上，而目標蛋白則洗脫下來。

四、基于內含肽的自我剪切法

內含肽(intein)是前體蛋白中的一段插入序列，能夠自我催化蛋白質的剪接(protein splicing)，使自身從前體蛋白中切除，并將兩側的外顯肽(extein)連接形成成熟的蛋白。

相比于化學法，自我剪切法條件溫和，不會導致目的蛋白的變性。相對傳統(tǒng)的酶切法需要多次過柱純化（不僅需要分離融合蛋白還需除去蛋白酶及融合標簽），自我剪切法簡化了純化過程，節(jié)約了成本和時間。 此外，自我剪切法具有良好的特異性，一般只在剪接位點的氨基酸殘基上發(fā)生切割，避免了酶切法由于第二識別位點因素的存在發(fā)生的非特異性切割。但是自我剪切法在誘導剪切時需加巰基試劑，會影響目標蛋白的二硫鍵。

以上4 種方法各有利弊，需要綜合考慮目標蛋白的特性，以及標簽移除方法和實驗目的，選擇合適的方法。

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