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骨肉瘤的Cu和Ce基氧化物納米平臺用于NIR-II熒光/磁共振雙模成像及免疫治療
本文要點：骨肉瘤是一種致命的骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年，具有局部破壞性和高轉(zhuǎn)移性。迫切需要針對骨肉瘤具有高治療效果和精確診斷的納米平臺。多模態(tài)光學(xué)成像和程序化治療，包括協(xié)同光熱-化學(xué)動力學(xué)治療 (PTT-CDT) 引發(fā)免疫遺傳性細胞死亡 (ICD) 是一種有前途的策略，它具有高生物成像靈敏度，可準確描繪骨肉瘤，副作用可忽略不計。
方案1. 骨肉瘤靶向mCu&Ce@ICG/RGD的構(gòu)建過程示意圖，用于NIR-II熒光/MR生物成像和PTT-CDT-ICD協(xié)同腫瘤抑制
本文開發(fā)了一種簡便的一步法合成具有介孔納米結(jié)構(gòu)的多功能 Cu&Ce 氧化物納米球 (mCu&Ce)。據(jù)報道，在 ICG 封裝和 RGD 肽表面接枝(mCu&Ce@ICG/RGD) 后，該納米平臺可準確識別骨肉瘤并在腫瘤微環(huán)境 (pH = 6.5) 下觸發(fā) ICG、Cu 和 Ce 離子的劇烈釋放（方案1）。進入骨肉瘤腫瘤細胞后，mCu&Ce@ICG/RGD 可在近紅外激光照射下有效產(chǎn)生高溫并進而促進•OH 的生成。PTT/CDT 協(xié)同腫瘤消融將在體外和體內(nèi)實現(xiàn)。同時，熱量和擴增的 ROS 都通過激發(fā) ICD 來激活有效的 T 細胞生成，從而產(chǎn)生全身抗骨肉瘤免疫反應(yīng)，從而顯著介導(dǎo)有效的腫瘤免疫治療。此外，基于Cu&Ce 的納米平臺可以通過 NIR-II 熒光和磁共振雙模生物成像對骨肉瘤進行精確的早期診斷。總之，本研究設(shè)計了一種具有雙模生物成像特性的簡便的 Cu&Ce 納米平臺。它可以特異性地識別骨肉瘤，并通過 PTT 增強的 CDT 實現(xiàn)癌細胞抑制，從而進一步顯著誘導(dǎo) ICD 增強。
圖1. mCu&Ce@ICG/RGD 的表征
圖2. pH 敏感生物降解、ROS 生成和高溫測定
由于mCe&Cu@ICG/RGD是為了激活I(lǐng)CG的釋放而設(shè)計的，因此在細胞外弱酸誘發(fā)下，mCe&Cu基框架生物降解發(fā)生了類Fenton反應(yīng)。在pH=6.5條件處理下的生物降解效率在所有時間點都明顯高于pH=7.4組，6h時框架初步崩潰，納米顆粒釋放，36h時所有納米球消失，出現(xiàn)大量Cu&Ce基顆粒。這些納米顆粒能夠傳導(dǎo)腫瘤組織浸潤。在腫瘤組織中細胞外弱酸性pH值浸泡36小時后，mCe&Cu@ICG/RGD的平均直徑從～68nm急劇下降到?～5nm ，?進一步表明結(jié)構(gòu)整體崩解。同時，在不同的孵育期內(nèi)還測定了pH=6.5生理緩沖液上清液中ICG的釋放曲線。我們觀察到ICG染料以時間依賴性方式逐漸釋放（圖2C）。同時，如pH=6.5條件下釋放的游離ICG的NIR-II發(fā)光圖像所示，熒光信號在36小時內(nèi)顯著增強，明顯強于pH=7.4組（圖 2D）。同時，在腫瘤微環(huán)境刺激緩沖液孵育不同時間后，Cu和Ce離子的釋放趨勢相似，孵育36h后約有90%的Cu/Ce離子被釋放。同時，在弱酸性環(huán)境下處理36h后，以商業(yè)•OH指示劑3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）評價Cu&Ce離子的類Fenton催化效果。在•OH催化下，產(chǎn)物氧化物TMB具有三個特征峰，顯然，與mCe&Cu@ICG/RGD + L基團相比，mCu@ICG/RGD僅表現(xiàn)出邊際ROS生成率，正如預(yù)期的那樣，mCe&Cu@ICG/RGD + H2O2?+ L 的•OH 增加量增加了 2 倍。納米平臺在高 H2O2條件下加上 808 nm 光照射時增強的化學(xué)動力學(xué)能力（圖 2E）。隨后，由于 ICG 對 808 nm 激光的強吸收賦予 mCe&Cu@ICG/RGD 強大的光熱轉(zhuǎn)換性能。如圖 2F、G 所示，納米平臺的溫度呈現(xiàn)出明顯的時間相關(guān)上升趨勢，在連續(xù) 300 秒的 808 nm 激光照射下溫度上升到79.1 °C，證明了快速的近紅外光響應(yīng)。與此形成鮮明對比的是，在相同處理下，PBS 溶液中的溫度略有上升，在激光照射終點僅為 36.3 °C。此外，為了進一步檢測激光-熱轉(zhuǎn)換效率（η），最近從冷卻-加熱循環(huán)計算了分散在水溶液中的mCe&Cu@ICG/RGD的熱量差異（圖 2H），具體的η值大約為～55.92 ?%（圖2I）同時，在四次808nm激光開關(guān)循環(huán)后也監(jiān)測到出色的光熱穩(wěn)定性（圖 2J）?？傮w而言，所有結(jié)果證實了負載ICG的腫瘤響應(yīng)性程序化介孔Cu&Ce納米載體可進一步應(yīng)用于通過PTT-CDT抑制惡性腫瘤。
圖3. PTT -CDT體外細胞殺傷及 ICD 指標的表達
如圖 3D所示，與其他制劑相比，用 mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L處理的 143b 和 b 細胞?介導(dǎo)了 CRT，這與細胞內(nèi) ROS 擴增結(jié)果一致。此外，該組中還顯示出 HMGB1 信號減弱，CRT 水平的這種相反趨勢進一步證明了我們的納米平臺增強的 ICD 效應(yīng)（圖 3D）。隨后，為了進一步說明 ICD 相關(guān)蛋白的表達，通過蛋白質(zhì)印跡分析研究了各種處理后 143b 中的 CRT 和 HMGB1 水平。顯然，當(dāng)用 mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2 + L 處理 143b 細胞時，CRT 在細胞膜上顯著上調(diào)，而 HMGB1 在細胞質(zhì)中顯著下調(diào)?（圖 3E 、F）。與mCu&Ce@ICG/RGD 組相比，mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L中上述表達的蛋白質(zhì)水平分別大約高出 2 倍和降低 5 倍?（圖 3I、J），揭示了該處理強大的 ICD激發(fā)能力。最后，分別用CLSM和流式細胞儀獲得活死染色圖像和細胞凋亡-壞死研究。與細胞內(nèi)ROS生成和HMGB1的結(jié)果類似，143b細胞在mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L中經(jīng)歷細胞死亡?（圖 3K -N）。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)mCu&Ce@ICG/RGD的濃度增加到300µg / mL時，H2O2預(yù)孵育加激光照射組中143b細胞的細胞活力僅為純納米平臺處理組的一半。這種腫瘤細胞殺傷力主要由PTT同時擴增的ROS和ICD介導(dǎo)。
圖4. 通過熒光成像、MRI 和光熱評估進行體內(nèi)腫瘤靶向性評估
之后，研究mCu&Ce@ICG/RGD在骨肉瘤荷瘤裸鼠模型中的生物分布和腫瘤富集行為。首先，為了獲得準確的腫瘤輪廓辨別，將mCu@ICG/RGD和mCu&Ce@ICG/RGD分別靜脈注射到荷瘤小鼠皮下，隨后在特定時間拍攝NIR-II熒光生物圖像，通過小動物NIR-II熒光成像生物系統(tǒng)監(jiān)測該納米平臺在體內(nèi)的腫瘤靶向性和生物分布。顯然，在注射mCu&Ce@ICG/RGD后2 h，腫瘤輪廓逐漸清晰，熒光信號（超過1000 nm）最初集中在腫瘤部位，腫瘤輪廓與周圍外周肌肉組織明顯區(qū)分開來；隨后，它隨著時間的推移而緩慢衰減，殘留納米平臺保持在48小時（圖 4 A）。而mCu@ICG/RGD的熒光信號主要分散在肝臟中，并且在所有時間間隔內(nèi)都明顯高于mCu&Ce@ICG/RGD組?；谠诟闻K中的這種高積累，后一組的腫瘤組織幾乎無法區(qū)分（圖 4 A）。同時，收獲腫瘤和主要器官進行離體NIR-II熒光生物成像。值得注意的是，即使可以看到上述兩組腫瘤中的比較光信號強度，mCu&Ce@ICG/RGD處理的肝臟的強度明顯低于mCu@ICG/RGD（圖 4 B）。此處，前者相對快速的生物降解行為有利于肝臟清除。因此，腫瘤與周圍正常組織的比例通過半定量平均NIR-II信號強度來計算。mCu&Ce@ICG/RGD 在注射后 24 小時的數(shù)值比 mCu@ICG/RGD 高 6 倍（圖 4D）。此外，本文還通過MRI 驗證了Cu 基納米平臺對腫瘤的特異性識別，以臨床Gd-DTPA 為對照。根據(jù)不同時間間隔的連續(xù) T1WI MRI 生物圖像，足底注射 mCu&Ce@ICG/RGD 的淋巴轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的 MRI 信號在注射后 24 小時急劇增加至峰值水平，從此時間點開始逐漸衰減至基礎(chǔ)強度（圖 4C）。然而，由于 Gd-DTPA 的快速排泄，可以在注射后 2 小時發(fā)現(xiàn)腫瘤積累。我們的納米平臺在 24 小時的腫瘤與組織比明顯高于 Gd-DTPA（圖 4E），進一步證明了mCu&Ce@ICG/RGD有效的腫瘤靶向能力，此時最合適進行激光照射進行PTT。最后，研究了皮下骨肉瘤小鼠尾靜脈注射PBS、mCu&Ce@ICG和mCu&Ce@ICG/RGD后在體內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換效果。具體而言，納米制劑處理的腫瘤部位溫度急劇變化，升高到峰值（分別為48.9和52.8°C），并且光熱維持率（圖 4F，G）。毫無疑問，這種現(xiàn)象主要歸因于RGD修飾的主動靶向能力。對于PBS處理的小鼠，即使經(jīng)過300秒的照射，溫度也僅略有升高（39.8°C）（圖 4F，G）。因此，上述體內(nèi)生物成像結(jié)果凸顯了多模對比納米劑在腫瘤診斷方面的潛力和令人滿意的腫瘤抑制熱療性能。
圖5. 體內(nèi) PTT CDT 和 ICD 評估
參考文獻
heng, M., Kong, Q., Tian, Q. et al. Osteosarcoma-targeted Cu and Ce based oxide nanoplatform for NIR-II fluorescence/magnetic resonance dual-mode imaging and ros cascade amplification along with immunotherapy. J Nanobiotechnol 22, 151 (2024).
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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS
NIR-II in vivo imaging system
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