活細(xì)胞的“聚光燈”——前沿活細(xì)胞成像的案例分享

細(xì)胞是一切生命的基本單位，構(gòu)成了各式各樣的生命體。因此研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部生命活動(dòng)過程可以幫助我們更深入地探究生命的奧秘，了解生命體是如何構(gòu)建和運(yùn)作的。傳統(tǒng)的細(xì)胞顯微術(shù)只能通過觀察固定的細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行推測(cè)，但已經(jīng)失“活”的細(xì)胞已經(jīng)無法反應(yīng)新陳代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等生命活動(dòng)，無法反應(yīng)活細(xì)胞的真實(shí)情況。因此活細(xì)胞顯微術(shù)越來越受到生命科學(xué)研究學(xué)者的青睞，能夠在細(xì)胞仍然活躍并處于正常生理活動(dòng)的狀態(tài)下進(jìn)行觀察，幫助科學(xué)家更好地研究細(xì)胞間的相互作用，以及進(jìn)行藥物研發(fā)和篩選等方面的應(yīng)用。在這里，我們整理了近幾年來自Lumencor的白光光源運(yùn)用于活細(xì)胞顯微術(shù)的前沿研究，希望能為您的研究帶來靈感。

細(xì)胞內(nèi)部Ca2+，線粒體膜電位和細(xì)胞質(zhì)乳酸的延時(shí)成像

來自威斯康星大學(xué)麥迪遜分校Sophia M. Sdao, Thuong Ho, Chetan Poudel等科學(xué)家研究了CDK2和β活細(xì)胞之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CDK2可以抑制β活細(xì)胞的氧化糖代謝和胰島素分泌，同時(shí)對(duì)β細(xì)胞的代謝信號(hào)和K(ATP)通道有重要影響。作者利用一個(gè)可誘導(dǎo)的β細(xì)胞特異性CDK2缺失的小鼠模型(CDK2-IKO)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這種小鼠的葡萄糖耐受性和葡萄糖刺激的胰島素分泌都有所提高。實(shí)驗(yàn)中通過多種方法測(cè)量了CDK2-IKO小鼠的β細(xì)胞電活性、鈣信號(hào)、NAD(P)H熒光壽命、乳酸水平和線粒體膜電位。在搭建延時(shí)成像生物傳感器時(shí)，采用Lumencor SOLA SEII 365作為熒光激發(fā)光源，并且基于Lumencor精確的電子控制系統(tǒng)，可以快速調(diào)節(jié)光輸出的強(qiáng)度，設(shè)置為<20%的功率輸出。

參考文獻(xiàn)

Sdao S M , Ho T , Poudel C ,et al.CDK2 limits the highly energetic secretory program of mature β cells by restricting PEP cycle-dependent KATP channel closure[J].Cell Reports, 2021, 34(4):108690.DOI:10.1016/j.celrep.2021.108690.

HuH-7人肝癌細(xì)胞中GFP表達(dá)的20小時(shí)延時(shí)成像

非病毒基因遞送是基因治療領(lǐng)域的一個(gè)快速發(fā)展的研究課題，其低免疫原性避免了免疫系統(tǒng)對(duì)外源基因的排斥和攻擊，提高了基因治療的安全性和有效性，但受到合成核酸納米載體在內(nèi)吞體內(nèi)停留時(shí)間的限制。為了克服這種瓶頸，需要一種能夠同時(shí)測(cè)量納米載體的攝取動(dòng)力學(xué)和轉(zhuǎn)染效率的方法。慕尼黑大學(xué)的研究人員A. Reiser, D. Woschée, N. Mehrotra等人使用單細(xì)胞陣列的活細(xì)胞成像(LISCA)來研究不同血清條件下基于脂質(zhì)mRNA復(fù)合物的遞送時(shí)間分布，文中使用HuH-7肝癌細(xì)胞作為系統(tǒng)模型（RNA治療的主要靶器官之一）。該方法可以同時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)百個(gè)單細(xì)胞的eGFP報(bào)告基因表達(dá)，通過擬合到模型，即可得到每個(gè)單細(xì)胞的表達(dá)起始時(shí)間和表達(dá)速率等參數(shù)。本文采用微結(jié)構(gòu)單細(xì)胞陣列和自動(dòng)活細(xì)胞延時(shí)顯微鏡來收集單個(gè)熒光時(shí)間過程。其中用于延時(shí)成像的時(shí)間分辨熒光顯微鏡搭載的即是來自Lumencor的SOLA-SE II LED光源。

參考文獻(xiàn)

Reiser A ,D Woschée, Mehrotra N ,et al.Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection[J].Integrative Biology, 2019, 11(9).DOI:10.1093/intbio/zyz030.

用高通量多色熒光顯微鏡觀察單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞雙鏈斷裂修復(fù)

來自瑞典烏普薩拉大學(xué)和皇 jia理工學(xué)院的研究人員Wiktor J, Gynn? A H, Leroy P等在Nature上發(fā)表了一篇探索活細(xì)菌中RecA螺旋絲如何通過同源重組修復(fù)雙鏈DNA斷裂（DSB）機(jī)制的文章。在一個(gè)可誘導(dǎo)的DSB系統(tǒng)中，利用高通量、微流控和熒光顯微技術(shù)，直接觀察大腸桿菌中DSB修復(fù)的過程，以及RecA蛋白在修復(fù)中的動(dòng)態(tài)變化，如下圖中所展示的。

在搭建實(shí)驗(yàn)所用的熒光顯微鏡時(shí)，Lumencor的Spectra III 系列的熒光光源與Nikon的Ti2-E倒置顯微鏡以及Andor的Sona 4.2B-11 scmos相機(jī)組合使用。顯微鏡由運(yùn)行內(nèi)建插件Micro-Manager控制。而熒光光源由相機(jī)通過TTL連接觸發(fā)，使用電子快門控制。Lumencor的TTL觸發(fā)輸入可以外部控制集成的八個(gè)光源的選擇以及開關(guān)，憑借精確的電子控制，切換速度間隔可達(dá)10μs。

參考文獻(xiàn)

Wiktor J, Gynn? A H, Leroy P, et al. RecA finds homologous DNA by reduced dimensionality search[J]. Nature, 2021, 597(7876): 426-429.

基因編碼電壓指示劑 （GEVI） JEDI-1P 在解離的大鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元中的成像

使用基因編碼的電壓指示劑（GEVI）進(jìn)行寬場(chǎng)成像是了解大型皮層網(wǎng)絡(luò)在神經(jīng)編碼行為中的作用的一種有前景的方法。萊斯大學(xué)以及埃默里大學(xué)的研究人員開發(fā)了一種針對(duì)單光子成像優(yōu)化的GEVI和改進(jìn)的方法，應(yīng)用于小鼠長(zhǎng)期的全腦電壓成像。并通過一個(gè)自動(dòng)化高通量篩選平臺(tái)，使其具有快速的動(dòng)力學(xué)、高亮度、高靈敏度和在寬常單光子照明下的高光穩(wěn)定性。在多輪定向進(jìn)化后，產(chǎn)生了在所有指標(biāo)上都有所提高的JEDI-1P，這是一種綠色的熒光指示劑，zui終研究人員成功在清醒小鼠中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的全腦電壓成像。

為了以高通量的方式評(píng)估GEVI的性能，研究人員搭建了一個(gè)基于倒置顯微鏡（A1R-MP,Nikon Instruments）自動(dòng)化多模式的96孔篩選平臺(tái)。由Lumencor的LED光引擎（SpectraX）產(chǎn)生激發(fā)光，通過液態(tài)光波導(dǎo)（LLG）引導(dǎo)至顯微鏡的熒光頂置照明器。其中青色光(中心波長(zhǎng)/帶寬，470/24nm)和綠光(550/15nm)通過物鏡分別照射到樣品臺(tái)上，激發(fā)基于GFP的GEVI以及mCherry。

Fura-2 Ca2+在小鼠垂體細(xì)胞中的成像

為了探究蛋白酪氨酸磷酸酶受體N和N2（PTPRN和PTPRN2）在小鼠繁殖過程中的性別特異性作用機(jī)制，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的尤尼斯肯 ni 迪施萊佛guo家兒童健康與人類發(fā)展研究所 (Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development)的研究人員對(duì)PTPRN和PTPRN2進(jìn)行雙敲除（DKO）,結(jié)果導(dǎo)致雌性小鼠不育，表現(xiàn)出青春期延遲、無排卵、卵巢基因表達(dá)和類固醇合成的改變。而雄性小鼠則大部分育性不受影響，睪丸的基因表達(dá)、類固醇合成以及生殖器官的發(fā)育沒有明顯影響。在研究過程中，鈣離子成像技術(shù)被用于研究垂體細(xì)胞的成像，研究PTPRN和PTPRN2的缺失對(duì)垂體促性腺激素細(xì)胞（gonadotrophs GnRH）的鈣信號(hào)的影響。340/30nm和380/20 nm的激發(fā)帶通由Retra II光引擎（Lumencor,Beaverton,OR）提供，激發(fā)帶通通過510/84nm的濾光片進(jìn)行了檢測(cè)。

圖中展示了一些GnRH（100pM）誘導(dǎo)培養(yǎng)垂體細(xì)胞中的鈣信號(hào)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)使用源自WT和DKO雄性和雌性小鼠的細(xì)胞進(jìn)行。

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