基于RTI（上圖）與SSI（下圖）的細(xì)胞系開發(fā)過程圖示^[1]

在基于RTI的細(xì)胞系開發(fā)過程中，攜帶轉(zhuǎn)基因遺傳信息和選擇標(biāo)記的線性化質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到CHO宿主細(xì)胞的基因組中。因此，具有不可預(yù)測結(jié)構(gòu)的多拷貝轉(zhuǎn)基因整合將發(fā)生在未知基因組位點(diǎn)上，代謝選擇后產(chǎn)生的細(xì)胞庫顯示出高水平的基因組和表型多樣性。對(duì)于基于SSI的CLD，能夠在基因組的特定位點(diǎn)精確插入或整合外源DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的添加、刪除或替換，可使得細(xì)胞庫顯示出較低的表型異質(zhì)性。相比于RTI，SSI具有高整合效率、外源基因可實(shí)現(xiàn)精確定位、基因表達(dá)具有一致性、減少位置效應(yīng)使得基因表達(dá)受控、提高細(xì)胞株的安全性及簡化篩選流程等優(yōu)勢。

BxB1整合酶定點(diǎn)整合外源基因

FLP/FRT重組酶定點(diǎn)整合外源基因圖示

Cre/Lox重組酶定點(diǎn)整合外源基因圖示

目前，已有一些制藥企業(yè)（武田制藥、羅氏、強(qiáng)生等）利用智能定點(diǎn)整合技術(shù)優(yōu)化其生物藥物的生產(chǎn)流程，包括開發(fā)穩(wěn)定細(xì)胞株用于大規(guī)模生產(chǎn)。而利用整合酶定點(diǎn)整合外源基因的方式對(duì)于國內(nèi)制藥企業(yè)來說目前還是處于萌芽階段。但定點(diǎn)整合技術(shù)對(duì)抗體藥物開發(fā)帶來的前景是可預(yù)期的，眾多生物制藥企業(yè)一直期盼能盡快將定點(diǎn)整合應(yīng)用于自身平臺(tái)中，加速細(xì)胞株的開發(fā)。

通過定點(diǎn)整合技術(shù)，將目標(biāo)基因序列通過同源重組的方式轉(zhuǎn)染到已經(jīng)通過前期篩選驗(yàn)證過的活躍位點(diǎn)當(dāng)中，構(gòu)建均一細(xì)胞池。其首先需要構(gòu)建平臺(tái)細(xì)胞，利用報(bào)告基因（如GFP 等） 篩選得到宿主細(xì)胞基因組中的高表達(dá)位點(diǎn)，之后利用重組酶的特異性，實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)產(chǎn)品基因插入在該表達(dá)量高、質(zhì)量和表達(dá)量穩(wěn)定的宿主細(xì)胞基因組位點(diǎn)，再利用Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)，獲得穩(wěn)定及高產(chǎn)的單克隆細(xì)胞株。

定點(diǎn)整合單克隆篩選流程

細(xì)胞類型：CHO-K1

細(xì)胞狀態(tài)：35%陽性率；80%活率

單細(xì)胞挑選設(shè)備：Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)，對(duì)照組：FACS

單細(xì)胞、單克隆率：

通過無熒光轉(zhuǎn)化子同源同組，細(xì)胞樣品內(nèi)有帶有熒光的母細(xì)胞也有無熒光即轉(zhuǎn)化子同組成功的目的細(xì)胞，12天后采用Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)進(jìn)行無熒光細(xì)胞鋪板（只分選非熒光的細(xì)胞），單細(xì)率約為85%，克隆恢復(fù)率約為20%，而對(duì)照組流式由于分選過程對(duì)單細(xì)胞狀態(tài)及活力造成損傷，后續(xù)單細(xì)胞難以恢復(fù)成克隆。此流程可以省去minipool與有限稀釋的環(huán)節(jié)，加快開發(fā)流程，值得一提的是，用定點(diǎn)整合方式，經(jīng)單細(xì)胞打印系統(tǒng)分選獲得的單克隆，后續(xù)產(chǎn)量＞5g/L，約為隨機(jī)整合表達(dá)量的1.5-2倍，此流程可降低開發(fā)時(shí)間和成本，提升開發(fā)效能，大大縮短整個(gè)工藝開發(fā)及IND申報(bào)時(shí)間。

智能定點(diǎn)整合技術(shù)在單克隆細(xì)胞株篩選中具有高效、精確和安全等顯著優(yōu)勢，當(dāng)然其也面臨技術(shù)復(fù)雜、成本高以及潛在脫靶效應(yīng)等挑戰(zhàn)，選擇使用SSI技術(shù)需綜合考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、成本和技術(shù)能力等因素。