Revvity小動物活體光學成像技術已在生命科學基礎研究、臨床前醫(yī)學研究及藥物研發(fā)等領域 得到廣泛應用。在眾多應用領域中，腫瘤免疫治療已經(jīng)成為活體光學成像技術的熱點之一。腫瘤免疫 治療被稱為繼手術、放療、化療后第四種療法；與傳統(tǒng)治療方式不同，免疫療法是激發(fā)或調(diào)動機體的 免疫系統(tǒng)，增強腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細胞，是療法是當前腫瘤治療領域前景的研究方向之一。因為近幾年在臨床實驗上取得的巨大成功，腫瘤免疫療法被Science雜志評 為2013年科學突破，目前腫瘤免疫療法策略主要包括腫瘤疫苗、細胞因子治療、抗體治療 和過繼性細胞治療四類。小動物活體光學成像技術可以在活體動物水平無創(chuàng)地監(jiān)測：1、疫苗、抗體、 免疫細胞等在體內(nèi)的分布及病灶靶向；2 、評價免疫療法的治療效果；3 、評價治療手段對機體免疫系 統(tǒng)的影響。以下將圍繞上述四類免疫療法策略，詳細介紹活體光學成像技術在腫瘤免疫治療中的應用。
一．腫瘤疫苗相關研究
腫瘤疫苗是通過激活患者自身免疫系統(tǒng)，利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導機體的特異性細胞免 疫和體液免疫反應，增強機體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散和復發(fā)，以達到清除或控制腫瘤的
目的。腫瘤疫苗分為預防性疫苗和治療性疫苗，前者將與某些特定腫瘤發(fā)生有關的基因制備成疫苗， 接種于具有遺傳易感性的健康人群，預防腫瘤的發(fā)生，后者主要用于化療后的輔助治療。根據(jù)腫瘤疫 苗的來源，又可分為腫瘤細胞疫苗、基因疫苗、多肽疫苗、樹突狀細胞疫苗、細胞毒性 T 淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）表位肽疫苗等。應用 Revvityr IVIS 小動物活體成像技術可以無創(chuàng)地監(jiān)測腫瘤疫苗 的預防及治療效果、疫苗在動物體內(nèi)的分布靶向及疫苗刺激機體產(chǎn)生的免疫效應等。
1. 以細菌為載體的預防性腫瘤疫苗
人表皮生長因子受體 2（HER2）的高表達、點突變及基因刪除與多種癌癥（乳腺癌，卵巢癌，胰 臟癌，胃癌和直腸癌）緊密聯(lián)系。單核細胞增多性李斯特菌（Lm，Listeria monocytogenes）是一種兼 性胞內(nèi)寄生菌，可以用于疫苗載體。給予 Balb /c 小鼠進行新型單核細胞增多性李斯特菌-人表皮生長因 子受體 2 嵌合疫苗免疫注射，然后靜脈注射螢火蟲熒光素標記的小鼠乳腺癌細胞（4T1-luc），利用 Revvityr 的 IVIS 成像系統(tǒng)即可實時監(jiān)測腫瘤的生長，進而評價疫苗的預防效果。結(jié)果顯示經(jīng)嵌合疫 苗免疫的乳腺癌模型小鼠的生物發(fā)光強度明顯弱于單核細胞增多性李斯特菌免疫的對照組（下圖） 。 研究表明細菌受體嵌合疫苗能夠明顯推遲肺癌腫瘤的發(fā)生，轉(zhuǎn)移，并能有效提高小鼠存活率

Balb/c 小 鼠 免 疫 單 核 細胞增 多性 李 斯特 菌 （control Lm），或者單核細胞增多性李斯特菌- 人表皮生長因子受體 2 嵌合疫苗（Lm-hHer2/neu chimera）。然后靜脈注射螢火蟲熒光素標記小鼠 乳腺癌細胞（4T1-luc）

Seavey et al.,Clin Cancer Res 2009;15(3):924-32.
.
2. 溶瘤病毒介導的治療性腫瘤疫苗

CG0070是在卡介苗（BCG）對膀胱癌安全性和劑量評價失敗后，Cell Genesys公司研制的腫瘤治療 性疫苗，該疫苗在2005年進入I期臨床試驗，涉及35例非肌肉浸潤性膀胱癌（NMIBC）的治療。目前Cold Genesys已經(jīng)引進該藥物，并在2014年3月開始招募2/3期研究，并有望在2018年獲得最終數(shù)據(jù)。CG0070 治療腫瘤的作用是通過雙重機制來完成的，首先該疫苗是一種條件復制型溶細胞腺病毒，可以直接靶 向腫瘤細胞并在腫瘤細胞中增殖，干擾腫瘤細胞生長；其次該病毒表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 （GM-CSF），使體內(nèi)樹突狀細胞和T細胞加入戰(zhàn)斗。Cell Genesys公司在研究中利用Revvityr的IVIS 系統(tǒng)，評價了在小鼠原位膀胱癌的移行細胞癌（TCC）模型中CG0070的抗腫瘤活性。結(jié)果顯示PBS組 小鼠給藥42天時較初次給藥，腫瘤的生物發(fā)光信號強度大幅增加（1只小鼠無明顯變化），在CG0070治 療組（1周1次，連續(xù)6周）9只小鼠中有4只在42天時已經(jīng)檢測不到腫瘤信號。而另一CG0070治療組（1 周2次，連續(xù)3周）中，8只動物中5只在32天時未檢測到腫瘤信號，1只小鼠的腫瘤信號減少，其他腫瘤 大小穩(wěn)定未增長，只有一只腫瘤信號增強。另外， 免疫組化結(jié)果顯示CG0070治療組中無腫瘤的小鼠在 膀胱組織未檢測出腫瘤細胞。

SW780-Luc 原位膀胱腫瘤模型評價CG0070效果。（ A – C）：建立模型后，小鼠膀胱灌注50 μl PBS或者CG0070 (3 ×1010病毒 顆粒/次) 共計6次，為了監(jiān)測腫瘤的生長，每周使用IVIS系統(tǒng)進行生物發(fā)光成像；圖像如上圖所示。D ：CG0070在瘤內(nèi)復制 的腫瘤切片圖（n=4），給藥24小時后取小鼠膀胱（a,c:PBS;b,d:CG0070），對石蠟包埋的膀胱組織切片進行染色，腫瘤檢 測使用人膀胱癌SW780細胞20AE1抗體(a和 b) ，病毒復制監(jiān)測進行hexon蛋白染色(c 和d)。二者免疫組化都使用
3,3V-diaminobenzidine 染色，箭頭所指為抗體相互作用的區(qū)域。 Ramesh et al., Clin Cancer Res.2006;12(1): 305-13.
3. 多肽類腫瘤疫苗

多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預測某段抗原表位的氨基酸序列，通過體外合成技術制 備而得到的多肽片段。Gp100 是胚胎早期出現(xiàn)的分化抗原，在黑色素瘤中過度表達，屬于黑色素腫瘤 相關抗原。gp100 疫苗（福氏不佐劑 IFA 為乳化劑）III 期臨床研究表明，使用疫苗免疫病人的客 觀有效率高于高劑量 IL-2 治療組一倍，同時也增加病人無疾病進展生存時間。然而在外周血增加的特 異性 CD8+T 細胞反應，并沒有有效的引起腫瘤的縮小，這一現(xiàn)象同樣是眾多疫苗臨床試驗中遇到的問 題。Yared Hailemichael 認為，這主要是由疫苗佐劑 IFA 引起的，該佐劑以礦物油為基礎，廣泛應用于 疫苗開發(fā)，以增強免疫應答。為了驗證這個論點，研究人員對 T 細胞進行了光學標記，并使用 Revvityr 的 IVIS 成像系統(tǒng)對 T 細胞進行長期追蹤。結(jié)果顯示，在接種了不含 IFA 疫苗的小鼠體內(nèi)，發(fā)光 T 細胞 大量存在于腫瘤中，而接種位點處很少；接種了含 IFA 疫苗的小鼠體內(nèi)，T 細胞在注射位點處聚集，

而腫瘤中很少。并且抗原/IFA 能夠持續(xù)在接種位點聚集，在接種30 天后仍能在該處刺激 T 細胞增殖。 最終使機體產(chǎn)生一系列誘導細胞蛋白，使接種處的 T 細胞。

gp100/IFA免疫導致CD8+T細胞啟動和低反應性。d.血液中pmel-1T細胞的平均數(shù)量（上）， 白化C57ABL/6小鼠接種黑色素瘤7 天，腫瘤大小可觸，經(jīng)疫苗免疫gp100/IFA(s.c) 或/和VSV.GP100（表達gp100的水泡炎病毒,iv），在IL-2治療3天后尾靜脈注射 1×106V-effLuc-pmel-1 T細胞，免疫4天后進行生物發(fā)光成像，T：腫瘤、V：免疫位點、 S ：脾臟；e.B16黑色素瘤模型小鼠， 在IL-2治療3天后尾靜脈注射1×106V-effLuc-pmel-1 T細胞，gp100/IFA或者control/IFAs.c.免疫7天后成像，圓圈顯示腫瘤的位置； 結(jié)果顯示VSV.GP100免疫小鼠后pmel-1 T細胞在血液中迅速擴增，并且在腫瘤中累積，而VSV.gp 100和gp100/IFA共免疫組，
在血液中也檢測出pmel-1T細胞，但是主要集中在注射位點，腫瘤中累積很少。

gp100/IFA免疫誘導長期的抗原遞呈和T細胞隔離。（a）白化C57ABL/6小鼠接種黑色素瘤7天，IL-2治療3天尾靜脈注射
1×106V-effLuc-pmel-1 T細胞，在皮下接種疫苗gp100/IFA的0天，-30天或者control/IFA的0天時進行成像及定量分析。之前結(jié)果 顯示，T細胞在注射位點的積累是抗原刺激產(chǎn)生的，此實驗考查的是gp100/IFA引起這種效應可以持續(xù)多長的時間，結(jié)果顯示， 相較其他位點，Pmel-1T細胞積累在0和30天前接種的gp100/IFA

使用短期水佐劑疫苗 T 細胞則定位在腫瘤。（a）白化 C57ABL/6 小鼠接種黑色素瘤 7 天，IL-2 治療 3 天尾靜脈注射
1×106V-effLuc-pmel-1 T 細胞，在皮下接種疫苗 gp100/IFA 的 0 天，-30 天或者 control/IFA 的 0 天時進行成像和定量分析。
結(jié)果顯示新型的鹽/肽/covax 疫苗比 IFA/肽/covax 疫苗更有優(yōu)勢，前者能使 T 細胞集中攻擊腫瘤細胞，而后者確使 T 細胞聚集 在集中的位點，殺死正常組織并誘導趨化因子的生成，最終導致 T 細胞的死亡。
Yared Hailemichael et al., Nature Medicine.2013; 9(4): 465-76.

4. 樹突狀細胞疫苗

樹突狀細胞（DC）是目前所知功能的專職抗原遞呈細胞。DC疫苗是將體外培養(yǎng)的負載腫瘤抗 原的DC導入體內(nèi)，這些DC通過抗原提呈功能及分泌細胞因子調(diào)節(jié)腫瘤抗原特異性、Th1細胞增殖活化， 并進一步促進NK細胞及CTL活化，介導腫瘤殺傷。例如在2010年4月29日第一個被FDA批準的治療性 疫苗Dendreon的Provenge正是DC疫苗。Laura Alaniz利用Revvityr IVIS小動物活體成像技術監(jiān)測了在 小鼠結(jié)腸癌模型中，通過低分子量透明質(zhì)酸（LMW HA）預處理的負載腫瘤抗原的DC疫苗，更傾向于 向淋巴結(jié)的遷移，從而增強誘導的抗腫瘤免疫反應。

BALB/c小鼠皮下接種5×105 個CT26細胞，建 立小鼠皮下瘤模型。在接種7天后，用脂溶性 熒光染料Dir標記DC/TL/LMW HA或DC/TL 細胞，并將1×106 標記的細胞，皮下注射到 腫瘤結(jié)節(jié)和局部淋巴結(jié)之間。48h后進行活體 或離體組織成像。

Laura Alanizetal., Cancer ImmunolImmunother.2011; 60(10):1383-95.

二．細胞因子療法
高純化或重組細胞因子生產(chǎn)的實現(xiàn)，為細胞因子在臨床的應用提供基礎。細胞因子療法是基于某 些細胞因子注射到體內(nèi)后可調(diào)節(jié)、增強一種或多種免疫細胞的功能，發(fā)揮更強的抗腫瘤免疫功能。目 前臨床上常用的細胞因子有白細胞介素 12（Interleukin-12,IL-12）、腫瘤壞死因-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、干擾素γ（Interferon-γ,IFN-γ) 及集落刺激因子（Colony Stimulating Factor ,CSF）等, 現(xiàn)細胞因子療法多與其他方式結(jié)合來進行腫瘤的治療。
白細胞介素13（Interleukin-13,IL-13)是一種T細胞衍生的II型細胞因子，在調(diào)節(jié)腫瘤進程、新血管 形成、免疫監(jiān)視和腫瘤轉(zhuǎn)移方面扮演著重要的作用。IL-13可以結(jié)合IL-13Rα1和IL-13Rα2兩個受體亞型， 刺激下游信號通路級聯(lián)放大，調(diào)節(jié)細胞的增殖和細胞抑制效應或腫瘤細胞死亡。其中IL-13Rα2已經(jīng)被 認為是多種惡性腫瘤細胞系和病人腫瘤組織的標志物，例如人類惡性膠質(zhì)瘤、頭頸癌、卵巢癌和腎細 胞癌等。因此靶向IL-13Rα2是一種合理的有前景的腫瘤治療手段。IL13-PE38由細胞因子IL-13和假單胞 菌外毒素（PE）的突變體組成，該復合物不僅對IL-13R2陽性的腫瘤具有高毒性，在IL-13R2陰性的腫 瘤轉(zhuǎn)染表達IL-13R2后，IL13-PE38同樣具有很高的敏感性。利用Revvityr的IVIS系統(tǒng)即可對

IL13-PE38對腫瘤的治療效果進行評價；結(jié)果顯示IL13-PE38和紫杉醇聯(lián)合對小鼠OSC-19舌腫瘤模型具 有很好的治療效果。


聯(lián)合用藥的藥效學評價。OSC-19 (2×105 cells/30μl)接種到6周齡裸鼠舌頭的邊緣， 建立原位的口腔鱗狀癌模型，腫瘤接種5 天后可見明顯腫瘤。小鼠隨機分為兩組 （6-7只/組），在第8天開始注射
IL13-PE38(100 μg/kg)，連續(xù)注射5天，隨后交 替3天注射紫杉醇(10 mg/kg/day)，并且分別在 第8天和第31天對腫瘤進行成像。箭頭所指的 是淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移 (b) 生物發(fā)光信號進行定量 分析代表腫瘤的生長曲線。


Mitomu KioiInt etal.,Int J Cancer. 2009;124(6):1440–8.

IFN-λ 是由T 細胞產(chǎn)生，具有抑制腫瘤細胞增殖、增加表面 MHC 抗原和腫瘤壞死因子的表達、抗 腫瘤血管生成等功能，在腫瘤臨床治療中應用多年。使用 IFN-λ 質(zhì)粒能夠調(diào)節(jié)體液和細胞免疫反應，
從而達到抗腫瘤或感染性疾病的目的。通過尾靜脈注射大體積的質(zhì)粒 DNA（水動力學注射方法）可引 起基因在嚙齒類動物肝臟的表達，因此該注射方法在靶向肝臟轉(zhuǎn)移位點進行基因遞送方面具有廣闊前 景。Atsuko Sato 在研究中利用Revvityr IVIS 成像系統(tǒng)評價了水動力學注射的 IFN-λDNA 質(zhì)粒在小 鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中的抗腫瘤效果。

通過水動力學注射IFN-λ cDNA治療肝轉(zhuǎn)移。Luc-Colon26細胞通過門靜脈接種在BALB/c的肝臟。a.海參熒光素酶表達載體作 為共注射的對照Marker來驗證水動力學的可行性，在注射海參熒光素酶的底物后BALB/c小鼠肝臟產(chǎn)生了大量光子；b.在腹腔
注射螢火蟲熒光素酶的底物后可監(jiān)測腫瘤的生長；c.通過測量肝臟的光子數(shù)來評價luc-Colon26肝臟的轉(zhuǎn)移；d.IFN-λ延長了肝 轉(zhuǎn)移小鼠的生存率；e.luc-B16/F10細胞毒性分析實驗，C57BL/6J 小鼠通過皮下注射輻射滅活的cDNA-轉(zhuǎn)染的luc-B16/F10細胞 進行免疫，隨后分離免疫小鼠的脾臟細胞，在E:T比例中作為效應細胞。光子數(shù)代表不同處理后細胞的存活；f.評價肺癌轉(zhuǎn)移 模型中各方法的治療效果。
Atsuko Satoetal.,J Immunol.2006;176(12):7686-94.

三．抗體療法
腫瘤免疫藥物的開發(fā)就技術成熟度和成功性來說，抗體技術是碩果累累?？贵w進行腫瘤的免疫治 療靶點主要是免疫檢驗點，或者結(jié)合正向共刺激因子的激動劑，例如西妥昔單抗（愛必妥）、帕尼單 抗（Vectibix）和曲妥珠單抗（赫賽?。┑??；蛘呓Y(jié)合負向共刺激因子的抑制劑，如熱點靶點 CTLA-4、 PD-1 、PD-L1 等。 目前 CTLA-4 單抗（lpilimumab）和 PD-1 單抗（nivolumab）已經(jīng)先后被 FDA 批準分 別用于治療晚期黑色素瘤和特定的轉(zhuǎn)移性鱗性非小細胞肺癌?，F(xiàn)在針對免疫檢驗點的單抗開發(fā)競爭十分 激烈，如 lambrolizumab(PD-1)和 MPDL3280A(PD-L1)已經(jīng)進入后期臨床，其他針對 OX40 、4-1BB 的 多個單抗在早期開發(fā)中。因為 T 細胞激活的靶點眾多，因此有望開發(fā)出新的抗體藥物，擴大腫瘤治療 的范圍。利用 Revvityr 的 IVIS 小動物成像技術可無創(chuàng)地對抗體的治療效果進行評價，同時也可對 藥物的靶向分布進行研究。

免疫檢驗點共信號機制
1. 藥效評價
利用熒光素酶標記腫瘤細胞，并移植入動物體內(nèi)建立腫瘤疾病動物模型，應用小動物活體光學成 像技術觀測給藥后腫瘤光學信號的變化情況，進而評價不同藥物、特定的給藥途徑、時間、劑量等給 藥策略對于腫瘤的治療效果，如下圖：

藥效評價研究：利用螢火蟲熒光素酶標記 MDA-MB-435 乳腺癌細胞株，將細胞注入小鼠腎包膜下構(gòu)建腎包膜腫瘤模型，進而 對 3 種不同藥物或不同劑量的治療效果進行評價。（A,C）應用 IVIS 成像系統(tǒng)長期觀測 3 種藥物對腎包膜乳腺癌移植瘤的治 療效果，并進行定量分析，結(jié)果顯示 30 mg/kg Docetaxel（TXT）對腫瘤的生長抑制；（B,D）應用 IVIS 成像系統(tǒng)長 期觀測 3 種藥物對腎包膜乳腺癌移植瘤肺部轉(zhuǎn)移的抑制效果，并進行定量分析，結(jié)果顯示 30 mg/kg Docetaxel（TXT）對腫瘤 轉(zhuǎn)移的抑制。
Zhang et al.,Clin Cancer Res.2009;15(1):238-46.
2. 觀測藥物靶向、分布及代謝
除了在藥效學中的應用，小動物活體光學成像也廣泛應用于藥物在體內(nèi)靶向、分布及代謝的研究。 與藥效學中的應用不同，此類應用是以藥物為直接觀測對象，因此標記方式通常是利用熒光探針直接 標記藥物本身，通過追蹤熒光信號而反映藥物在體內(nèi)的分布情況。
例如在研究抗體或多肽類藥物是否能夠有效靶向腫瘤的實驗中，可以利用熒光染料通過化學鍵的 結(jié)合標記目標抗體或多肽，經(jīng)尾靜脈注射后，利用小動物活體光學成像系統(tǒng)觀測上述標記對象的腫瘤 靶向性，如下圖：

藥物的腫瘤靶向性研究：利用 VivoTag 645 熒光染料標記抗癌藥物曲妥珠單抗(Trastuzumab)，尾靜脈注入攜帶 HER2 陽性人 卵巢癌 SKOV3 的 SCID 小鼠體內(nèi)，通過熒光成像觀測不同時間點藥物對腫瘤的靶向情況（左上圖后三列），腫瘤本身已被熒 光素酶標記而通過生物發(fā)光成像（左上圖最左列），右上圖為熒光定量分析結(jié)果，標明曲妥珠單抗對 HER2 陽性的人卵巢癌 SKOV3 具有良好靶向性。
在研究藥物靶向的同時，了解不同時間點藥物在動物體各個器官的分布及最終代謝情況同樣。Revvityr 的 FMT 小動物活體熒光斷層成像系統(tǒng)可以很好的滿足此類應用需求。應用FMT 成 像系統(tǒng)，能夠?qū)晒鈽擞浀乃幬镌谏顚悠鞴俚姆植歼M行斷層掃描及三維重建，獲得真實準確的三維定 量數(shù)據(jù)，進而對藥物的體內(nèi)分布代謝情況作出正確分析。如下圖：

上圖左：利用 FMT 成像系統(tǒng)觀測不同時間點經(jīng)熒光染料 VivioTag 680 標記的 BSA 在小鼠不同器官的分布；上圖右：不同時 間點不同器官 BSA 分布的定量結(jié)果。
四．過繼性免疫細胞療法
過繼性免疫細胞治療（adoptive cell transfer therapy ，ACT），是指從腫瘤患者體內(nèi)分離免疫活性細 胞，在體外進行擴增和功能鑒定，然后向患者回輸，從而達到直接殺傷腫瘤或激發(fā)機體的免疫應答殺 傷腫瘤細胞的目的。ACT 分為非特異性免疫治療（如CIK 細胞治療、LAK 療法）及特異性免疫治療（如

嵌合抗原受體 T 細胞免疫療法，CAR-T）。尤其是 CAR-T 細胞療法已經(jīng)成為細胞療法中的熱點，其中 Novartis 團隊主導的二期臨床實驗取得了迄今腫瘤免疫界結(jié)果，在三十個病人中，二十七患者已 經(jīng)沒有臨床腫瘤的癥狀和腫瘤的指征。而在國內(nèi)北大國際醫(yī)院等機構(gòu)也都在進行CAR-T 細胞治療研究， 并已經(jīng)進入臨床試驗階段。
人類NK細胞，在抗腫瘤中起著重要的作用，代表表達CD3-/CD56+ 的大顆粒淋巴細胞群。NK細胞 通過NK細胞受體和靶細胞配體之間的相互作用來區(qū)分正常細胞和轉(zhuǎn)化的細胞。轉(zhuǎn)染TNF配體超家族成 員的41BBL和IL15的K562細胞（K562-mb15-41BBL）經(jīng)輻射滅活后能夠刺激NK細胞高度活化并大量的 擴增。經(jīng)K562-mb15-41BBL活化的NK細胞高表達IFN-γ、TNF等。Tarun K等研究了這種NK細胞體系對 多發(fā)性骨髓瘤的治療作用。研究中將穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素的白血病細胞系OPM2接種在
NOD/scid/IL2Rγnull小鼠皮下后，利用Revvityr IVIS小動物活體成像技術可實時檢測腫瘤的生長，從 而對exp-NK細胞的療效進行評價。

NOD/scid/IL2Rγnull-hu模型中，exp-NK細胞顯著抑制轉(zhuǎn)染熒光素酶基因的OPM2骨髓瘤的生長。(A)3×105OPM2-luc細胞皮下 接種，7天后可見明顯腫瘤。隨后分別給予PBS和總劑量160×106 exp-NK細胞（分4次注射，間隔48h）進行處理，并在不同時 間點對腫瘤進行生物發(fā)光成像（Day0代表NK細胞注射的時間）。#1.一周兩次靜脈注射 IL2 (100 U)，延長模型小鼠存活時間；
(B)各組相對體積進行比較，結(jié)果顯示與對照和低劑量組相比160×106 exp-NK細胞治療組腫瘤體積最小。 Tarun K..et al.haematologica.2012;97(9):1348-57.

繼發(fā)性T細胞對于治療多種癌癥具有很好的前景，但是臨床應用時遇到一個問題，即如何將靶向淋 巴細胞遞送到腫瘤位點并在免疫抑制的微環(huán)境中擴增。Stephan在研究中設計了一個具有生物活性的多 聚物，通過將移植物置于無法手術的腫瘤附近或部分切除腫瘤的切除位點，能夠遞送、擴增和分散腫 瘤激活的T細胞。利用螢火蟲熒光素酶標記腫瘤細胞，甲殼蟲熒光素酶標記腫瘤特異性T細胞，使用
Revvityr IVIS成像系統(tǒng)即可監(jiān)測腫瘤的生長及T細胞的分布。成像結(jié)果顯示在小鼠乳腺癌切除模型 中移植物能夠有效的支持腫瘤靶向的T細胞通過切除位點與淋巴結(jié)交集，減少腫瘤的復發(fā)。在多病灶的 卵巢癌轉(zhuǎn)移模型中多聚物遞送的T細胞能夠?qū)е履[瘤的退化，而只用腫瘤活化的T細胞進行治療時效果 甚微。

不同處理方式下腫瘤和T細胞的成像，建立小鼠4T1-luc乳腺癌脂肪墊模型，乳腺癌特異性T細胞分離自經(jīng)輻射滅活的4×106 4T1 B7.1/4-1BBL免疫的BALB/c小鼠（輔助CpG基序的寡脫氧核苷酸和Poly(I:C)），獲取的特異性T細胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式 獲得CBR-LUC基因，成像前分別注射F-luc和CBR-luc的底物進行腫瘤或T細胞的生物發(fā)光成像。

不同處理方式下腫瘤和T細胞的成像， 建立小鼠ID8-VEGF-luc卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移模型，為了獲得卵巢癌特異性（NKG2D CAR-transduced）T細胞，取C57BL/6J小鼠的脾臟，過濾后重懸于裂解液中，分離的脾細胞使用含1 ng/ml interleukin-7和2μg/ml Concavalin A的培養(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)，并純化獲得CD8+效應T細胞， CD8+效應T細胞先后轉(zhuǎn)染NKG2D-CAR基因和 CBR-luc。成像前分別注射F-luc底物和CBR-luc的底物進行腫瘤或T細胞的生物發(fā)光成像。
Sirkka B Stephan etal.,nature biotechnology.2015;33(1):97-104.

多形性成膠質(zhì)細胞瘤是有侵略性的原發(fā)性腦瘤。目前來說，手術切除結(jié)合放射和化學療法是 治療多形性成膠質(zhì)細胞瘤方法。然而對于中老年患者，放射和化學治療只能減緩而不能阻止腫 瘤細胞生長。CD133+腫瘤干細胞的化學和放射療法耐藥性能夠解釋傳統(tǒng)療法低效率的原因。正位異種 移植螢火蟲熒光素酶標記的患者來源的多形性成膠質(zhì)細胞瘤細胞到免疫缺陷小鼠（SCID）前額葉，建 立多形性成膠質(zhì)細胞瘤小鼠模型。腫瘤內(nèi)注射 HER2 靶向的嵌合性 T 細胞，Revvityr 的 IVIS 系統(tǒng) 成像顯示經(jīng)過特異性 HER2+T 細胞治療小鼠的生物發(fā)光明顯下降（下圖）。結(jié)果說明特異性 HER2+T 細 胞能夠抑制多形性成膠質(zhì)細胞瘤的生長，從而對多形性成膠質(zhì)細胞瘤患者進行有效治療。

上圖：首行（沒有治療的多形性成膠質(zhì)細胞瘤小鼠）中行（T 細胞治療多形性成膠質(zhì)細胞瘤小鼠）末行（特異性 HER2+ T 細 胞治療多形性成膠質(zhì)細胞瘤小鼠）。

Ahmed et al, Clinical Cancer Research, 2010;16(2):474-86.