Revvity小動物活體光學(xué)成像技術(shù)已在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床前醫(yī)學(xué)研究及藥物 研發(fā)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在眾多應(yīng)用領(lǐng)域中，腫瘤研究是目前應(yīng)用最為普遍的領(lǐng)域之 一。常用于腫瘤活體成像的光學(xué)標(biāo)記方法包括：1、利用螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）或熒光蛋白作為報(bào)告基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)體外標(biāo)記腫瘤細(xì)胞而直接觀測腫 瘤的發(fā)展變化，或標(biāo)記特定基因而研究腫瘤相關(guān)基因在腫瘤發(fā)展中的作用；2、通過外 源注射功能性熒光探針，觀測腫瘤發(fā)展過程中的分子事件，進(jìn)而反映腫瘤的發(fā)展變化。 宏觀來說，應(yīng)用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行腫瘤研究主要集中于三個方面：1、長時(shí) 間監(jiān)測腫瘤生長及轉(zhuǎn)移；2、抗腫瘤藥物研發(fā)；3、癌癥分子機(jī)理研究。下面結(jié)合一些具 體實(shí)例進(jìn)行闡述：

一. 長時(shí)間監(jiān)測腫瘤生長及轉(zhuǎn)移

隨著腫瘤研究的深入，應(yīng)用傳統(tǒng)方法（如卡尺測量腫瘤體積、腫瘤組織切片等）進(jìn) 行腫瘤研究已存在諸多限制。如進(jìn)行組織切片觀測前需要處死小鼠取出腫瘤組織，因此， 在不同時(shí)間點(diǎn)或不同實(shí)驗(yàn)組都需要處死一批實(shí)驗(yàn)小鼠以獲取足夠的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，這樣不 但大大增加了實(shí)驗(yàn)成本，而且很難消除由于小鼠個體差異而產(chǎn)生的誤差，無法獲取可靠 的重復(fù)性數(shù)據(jù)，同時(shí)，在制作切片時(shí)也無法保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，而利用活體光學(xué)成像技 術(shù)可以對同一批小鼠進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的長時(shí)間觀測，進(jìn)而大幅降低實(shí)驗(yàn)成本，并獲取重 復(fù)可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；

又如通過利用卡尺測量腫瘤體積的方法，只能等腫瘤發(fā)展至可以測量的程度才能開 展實(shí)驗(yàn)，因此，無法進(jìn)行腫瘤早期觀測及微小轉(zhuǎn)移灶的觀測，而利用靈敏的生物發(fā)光成 像技術(shù)在腫瘤發(fā)生早期即可進(jìn)行有效觀測，從而對腫瘤的整個發(fā)展過程進(jìn)行全程監(jiān)測， 有力彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的缺陷。下面幾個例子展示了應(yīng)用生物發(fā)光成像技術(shù)長時(shí)間監(jiān)測腫 瘤的生長及轉(zhuǎn)移。

二.抗腫瘤藥物研發(fā)

Revvity的小動物活體光學(xué)成像技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療藥物的臨床前研發(fā)階段 ，發(fā)揮越來越重要的作用。全球各大制藥企業(yè)均已采用活體光學(xué)成像技術(shù)開展抗腫瘤新 藥的研發(fā)，其中已有6種藥物獲得FDA認(rèn)證，另有8種藥物處于臨床測試階段。

應(yīng)用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行新藥研發(fā)，主要包括以下方面：1、在活體動物 水平進(jìn)行藥效評價(jià)；2、觀測藥物在活體動物體內(nèi)的靶向、分布及代謝。 1、藥效評價(jià) 利用熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，并移植入動物體內(nèi)建立腫瘤疾病動物模型，應(yīng)用小動 物活體光學(xué)成像技術(shù)觀測給藥后腫瘤光學(xué)信號的變化情況，進(jìn)而評價(jià)不同藥物、特定的 給藥途徑、時(shí)間、劑量等給藥策略對于腫瘤的治療效果，如下圖：

相對于觸診、腫瘤體積測量等傳統(tǒng)方法，利用高靈敏度的生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行藥物評價(jià)，可以更靈敏的發(fā)現(xiàn)殘余病灶點(diǎn)或盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)，從而更準(zhǔn)確的對藥物治療效果進(jìn)行判定，如下例：

利用生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行藥效評價(jià)的另一優(yōu)勢在于，可以明確判斷藥物是否 有效殺死腫瘤活細(xì)胞。這是由于生物發(fā)光的原理是基于活細(xì)胞環(huán)境的酶促反應(yīng)，因此， 能夠發(fā)光的細(xì)胞必定是具有活性的。下圖所示為輝瑞公司抗腫瘤藥物Sutent的部分研究 結(jié)果，研究人員首先利用卡尺測量腫瘤體積的方法觀測該藥物對于腫瘤的生長抑制情 況，發(fā)現(xiàn)該藥物能夠延緩腫瘤的生長，但體積測量數(shù)據(jù)顯示腫瘤并未變小，研究人員隨 后利用生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行觀測，發(fā)現(xiàn)給藥一定時(shí)間后腫瘤光學(xué)信號顯著降低，說明 該藥物對腫瘤活性細(xì)胞確實(shí)具有殺傷作用，同時(shí)說明單獨(dú)依靠腫瘤體積測量的方式無法 準(zhǔn)確真實(shí)反映藥物治療效果。憑借活體光學(xué)成像的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Sutent得以順利通過FDA 的認(rèn)證。

除了應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)研究藥物對于腫瘤的治療效果之外，熒光成像技術(shù)同樣可以 應(yīng)用于此類研究，主要方式為通過外源注射功能性熒光試劑觀測藥物對于腫瘤某一方面 的治療情況，如利用反映血管生成的熒光試劑觀測藥物對于腫瘤血管新生的抑制情況， 又如利用反映細(xì)胞凋亡的熒光試劑觀測由于藥物治療而誘發(fā)的腫瘤細(xì)胞凋亡情況。

2、觀測藥物靶向、分布及代謝

除了在藥效學(xué)中的應(yīng)用，小動物活體光學(xué)成像也廣泛應(yīng)用于藥物在體內(nèi)靶向、分布 及代謝的研究。與藥效學(xué)中的應(yīng)用不同，此類應(yīng)用是以藥物為直接觀測對象，因此標(biāo)記 方式通常是利用熒光探針直接標(biāo)記藥物本身，通過追蹤熒光信號而反映藥物在體內(nèi)的分 布情況。 例如在研究抗體或多肽類藥物是否能夠有效靶向腫瘤的實(shí)驗(yàn)中，可以利用熒光染料通過化學(xué)鍵的結(jié)合標(biāo)記目標(biāo)抗體或多肽，經(jīng)尾靜脈注射后，利用小動物活體光學(xué)成像系 統(tǒng)觀測上述標(biāo)記對象的腫瘤靶向性，如下圖：

事實(shí)上，直接通過熒光染料標(biāo)記藥物注入體內(nèi)的方式存在諸多問題，如低靶向性、 低藥效性、免疫排斥、藥物毒性問題等。因此，構(gòu)建新型藥物載體也是目前藥物研究的 熱點(diǎn)之一，應(yīng)用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)同樣可以在這一領(lǐng)域發(fā)揮作用。如下圖所示為 研究人員通過小動物活體光學(xué)成像技術(shù)觀測一種新型納米共聚物給藥載體在體內(nèi)運(yùn)載 嗎啉基反義寡核苷酸靶向治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)。此類給藥載體包含多種組分，如起整體保護(hù) 作用的外層多聚蘋果酸骨架及聚乙二醇、起腫瘤靶向作用的抗體連接組分、藥物釋放組 分、熒光染料結(jié)合位點(diǎn)等。結(jié)果表明，通過應(yīng)用新型納米給藥載體可以有效提升藥物的 靶向治療效果。

在研究藥物靶向的同時(shí)，了解不同時(shí)間點(diǎn)藥物在動物體各個器官的分布及最終代謝 情況同樣。Revvity的FMT小動物活體熒光斷層成像系統(tǒng)可以很好的滿足此類應(yīng)用需求。應(yīng)用FMT成像系統(tǒng)，能夠?qū)晒鈽?biāo)記的藥物在深層器官的分布進(jìn)行斷 層掃描及三維重建，獲得真實(shí)準(zhǔn)確的三維定量數(shù)據(jù)，進(jìn)而對藥物的體內(nèi)分布代謝情況作 出正確分析。如下圖

應(yīng)用活體熒光成像技術(shù)進(jìn)行藥物分布的觀測目前主要局限于對生物大分子藥物的 研究，而對天然或化學(xué)小分子藥物的分布代謝研究主要依靠的是放射性核素標(biāo)記成像 （PET 或 SPECT），原因是用相對大分子量的熒光染料標(biāo)記小分子藥物，則熒光染料 本身即會對小分子藥物在體內(nèi)的分布代謝產(chǎn)生影響，因此無法將活體熒光成像技術(shù)應(yīng)用 于此類研究。然而，科研人員最近發(fā)現(xiàn)應(yīng)用高靈敏度的 IVIS 活體光學(xué)成像系統(tǒng)可以觀 測到放射性核素在小鼠體內(nèi)發(fā)出的光學(xué)信號，其所依據(jù)的是切倫科夫輻射（Cherenkov Radiation）原理，由此拓展了活體光學(xué)成像技術(shù)的應(yīng)用范疇，即利用活體光學(xué)成像系統(tǒng) 觀測經(jīng)放射性核素標(biāo)記的小分子藥物在體內(nèi)的分布代謝。

三.癌癥分子機(jī)理研究

對于癌癥分子機(jī)理的研究之前一直局限于體外水平，體外研究的缺陷在于無法模擬 腫瘤在動物體內(nèi)真實(shí)的生理微環(huán)境，因此，單一的體外研究結(jié)果并不能反映癌癥的 發(fā)生發(fā)展機(jī)理。小動物活體光學(xué)成像技術(shù)使科研人員能夠進(jìn)一步將癌癥分子機(jī)理的研究 由體外拓展至體內(nèi)，如在活體動物水平研究癌癥相關(guān)基因在癌癥發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作 用、觀測腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中特異性分子事件的發(fā)生等。

1、應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)研究癌癥相關(guān)基因的作用

應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行癌癥相關(guān)基因的研究方法，主要利用熒光素酶標(biāo)記特定基 因，構(gòu)建特定基因-熒光素酶的共表達(dá)載體，通過熒光素酶產(chǎn)生的生物發(fā)光信號反映該 基因的表達(dá)情況，研究該基因的相關(guān)作用。以下幾個例子是應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)研究癌癥 相關(guān)基因在不同腫瘤模型中作用： p53 是調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生命活動的一種重要基因，控制著細(xì)胞周期的啟動。p53 也同 時(shí)被認(rèn)為是一種重要的抑癌基因，在人類50%以上的腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了p53基因的突 變，這是腫瘤中最常見的遺傳學(xué)改變，說明該基因的改變很可能是人類腫瘤產(chǎn)生的主要 發(fā)病因素。下圖所示是發(fā)表于2007年Nature雜志上的一篇研究p53抑癌作用的文獻(xiàn)結(jié) 果。研究者將一個同時(shí)帶有致癌基因ras、四環(huán)素反式激活因子tTA (‘tet-off’)及四環(huán)素 依賴性p53 shRNA 的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體與熒光素酶基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染從小鼠胚胎提取 的成肝細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于小鼠肝臟，觀測p53基因表達(dá)關(guān)閉或開啟對于肝癌發(fā) 生或消亡的作用。結(jié)果顯示，當(dāng)p53的表達(dá)被shRNA抑制時(shí)，通過生物發(fā)光觀測到的 腫瘤信號逐漸增強(qiáng)，而當(dāng)給小鼠注入強(qiáng)力霉素（doxycycline）開啟p53的表達(dá)后，肝癌 細(xì)胞的生物發(fā)光信號逐漸減弱，說明p53的表達(dá)能夠抑制腫瘤的生長并促使腫瘤消亡。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，而乳腺癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因， 乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理目前還不清楚。LSD1是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶， 理論上對基因轉(zhuǎn)錄起廣泛調(diào)控作用，但近期研究卻表明LSD1只參與一些特異的細(xì)胞信 號通路的調(diào)控而且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。北大醫(yī)學(xué)部尚永豐教授課題組應(yīng)用 IVIS 活體光學(xué)成像系統(tǒng)觀測到LSD1能抑制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而揭示了LSD1這 一表觀調(diào)控因子在抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移中的重要作用，并為乳腺癌轉(zhuǎn)移的干預(yù)提供了新的分 子靶點(diǎn)。上述結(jié)果發(fā)表于2009年Cell雜志。

腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點(diǎn)與干細(xì)胞的基本特性十分相似，因此，有學(xué)者提 出腫瘤干細(xì)胞（Cancer\Tumor Stem Cell, CSC\TSC）的理論。腫瘤干細(xì)胞可以長時(shí)間處 于休眠狀態(tài)并具有多種耐藥分子而對殺傷腫瘤細(xì)胞的外界理化因素不敏感，導(dǎo)致腫瘤往 往在常規(guī)治療方法消滅大部分普通腫瘤細(xì)胞后一段時(shí)間復(fù)發(fā)。因此，如果能夠?qū)ふ业侥[ 瘤干細(xì)胞特異性治療靶標(biāo)，將為腫瘤治療開辟新的路徑。OCT4是參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞 自我更新和維持其全能性的最重要的轉(zhuǎn)錄因子之，因此，OCT4可能是殺傷腫瘤干 細(xì)胞的潛在靶點(diǎn)之一。下述實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用IVIS系統(tǒng)觀測OCT4在乳腺癌細(xì)胞成瘤中的作 用。研究者將帶有OCT4基因的載體轉(zhuǎn)染經(jīng)熒光素酶標(biāo)記的鼠源乳腺癌細(xì)胞株4T1-luc， 并分選出高表達(dá)及低表達(dá)OCT4基因的細(xì)胞株，分別原位接種于小鼠胸部乳腺脂肪墊， 觀測結(jié)果顯示OCT4高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株具有更高的成瘤性。

2、應(yīng)用功能性熒光試劑觀測腫瘤內(nèi)部特異性分子事件的發(fā)生

腫瘤發(fā)展進(jìn)程中伴隨著諸多分子事件的發(fā)生，如某些蛋白酶的表達(dá)特異性升高、某 些表面標(biāo)識物的特異性表達(dá)、腫瘤周邊血管的新生、腫瘤組織局部缺氧等，通過觀測這 些分子事件能夠判斷腫瘤的發(fā)展程度并作出預(yù)后。Revvity提供了一系列應(yīng)用于腫瘤研 究的功能性熒光試劑，使上述觀測成為可能。以下為具體應(yīng)用實(shí)例：應(yīng)用PSA 750 FAST酶激活類熒光試劑觀測PSA+前列腺腫瘤

前列腺特異抗原(Prostate Specific Antigen，PSA) 主要是由前列腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的 蛋白分解酶，正常情況下被分泌入前列腺液或精液中以有活性的游離形式存在，血清中 的 PSA 主要以結(jié)合形式存在。正常及良性前列腺增生的前列腺上皮均可分泌游離或結(jié) 合形式的PSA，但具有酶活性的PSA只存在于惡性前列腺腫瘤中。PSA 750 FAST是一 種只能被具有酶活性 PSA 特異性激活的熒光試劑，因此可用于監(jiān)測前列腺腫瘤的惡性 程度。

應(yīng)用IntegriSense 及 ProSense 熒光試劑觀測腫瘤血管新生及組織蛋白酶的表達(dá)

腫瘤的發(fā)生發(fā)展伴隨著諸多分子事件的共同發(fā)生，應(yīng)用不同種類的熒光試劑，可以 實(shí)現(xiàn)在一個實(shí)驗(yàn)中觀測腫瘤內(nèi)部的多個生物學(xué)進(jìn)程。如下圖所示，在一個實(shí)驗(yàn)中同時(shí)利 用IntegriSense 及 ProSense 兩種熒光試劑對腫瘤進(jìn)行觀測：應(yīng)用IntegriSense750靶向類 熒光試劑可以靶向監(jiān)測腫瘤血管上皮特異性表達(dá)的整聯(lián)蛋白αvβ3而反映腫瘤的血管新 生；而應(yīng)用ProSense680酶激活類熒光試劑能夠監(jiān)測腫瘤細(xì)胞中組織蛋白酶的活性，進(jìn) 而揭示兩種對象在腫瘤內(nèi)部的不同分布及藥物（Avastin）治療后的不同變化。

應(yīng)用HypoxiSense 及 AngioSense 熒光試劑觀測腫瘤微環(huán)境

腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境有著密切關(guān)系，了解腫瘤微環(huán)境對于 腫瘤的診斷、防治和預(yù)后有著重要意義。下圖所示為利用監(jiān)測腫瘤組織缺氧的 HypoxiSense 靶向類熒光試劑與監(jiān)測腫瘤血管生成的AngioSense血管生理類熒光試劑共 同觀測小鼠皮下接種的人宮頸癌腫瘤微環(huán)境。其中，HypoxiSense 能夠特異性靶向缺氧 腫瘤細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)的碳酸酐酶9（CAIX），進(jìn)而表征腫瘤的缺氧區(qū)域；而AngioSense 通過富集于由于腫瘤血管新生而引發(fā)的血管滲漏區(qū)域，進(jìn)而表征腫瘤的血管富集區(qū)域。 定量結(jié)果顯示缺氧部位主要位于腫瘤內(nèi)部中心區(qū)。